Immunodiffusion af antigen eller antistoffer
Immunodiffusion af antigen eller antistoffer!
Immunodiffusion henviser til bevægelsen af antigen eller antistof eller begge antigen- og antistofmolekyler i et bærermedium ved diffusion.
Antigenet og antistoffet binder sammen og danner uopløseligt immunpræcipitat, som er synligt for blotte øjne som bundfældningsbånd eller -linie. J. Oudin beskrev et system med enkelt diffusion af antigen og antistof i agarfyldte rør.
Snart beskrev Ouchterlony dobbelt diffusion i agar, lagdelt på dias. Bevægelsen beskrives også som enten lineær eller radial. Immunodiffusionsmetoderne anvendes til kvalitativ og kvantitativ analyse af serumproteiner. Imidlertid har mere følsomme og specifikke metoder som enzymbundet immunoabsorbentassay (ELISA) og radioimmunassay (RIA) næsten erstattet immunodiffusionsmetoderne.
Single Immunodiffusion:
Antingen eller antigenet forbliver fikset, og den anden reaktant bevæger sig (Diffusionsteknik af Oudin).
Dobbelt Immunodiffusion:
Både antigen og antistof er frie til at bevæge sig mod hinanden. (Ouchterlony teknik).
Smeltet agar hældes på glasskinne eller petrid og får lov at størkne. To små brønde på få millimeter afstand fra hinanden er udstanset. Antigen og tilsvarende antistofopløsninger tappes i modstående brønde. Glideren / petridishen holdes derefter i et fugtigt kammer i 18-24 timer. Antigenet og antistoffet bevæger sig gennem agar og kombineres til dannelse af antigen-antistofkompleks. Antigen-antistofkomplekset er synligt som en udfældningslinie.
Dobbeltdiffusion udføres også ved at placere antigen- og antistofbrønde i forskellige vinkler til sammenligning. De tre mønstre af disse reaktioner er vist i figur 27.2.
jeg. Identitetsreaktion:
Antigener i to brønde er identiske (Agl og Ag2). Således resulterer reaktionen med antistoffet i en netop lignende udfældningslinjer. Fældningslinjerne krydser ikke, men danner en kontinuerlig linje. Fusion af de to præciplinelinier indikerer, at antistoffet reagerer med epitoper, som ofte er til stede på de to antigener.
ii. Reaktion af ikke-identitet:
To ikke-identiske antigener (Agl og Ag3) er i antigenbrøndene, mens antistofbrønden har antistoffer mod begge antigener. De to dannede antigen-antistofpræciplinjer adskiller sig fra hinanden. Derfor krydser de to præcisionslinjer fuldstændigt hinanden.
iii. Reaktion af partiel identitet:
De antigeniske determinanter i antigenerne af to brønde deles delvist (Agl og Agla). Derfor reagerer antistoffet med både antigenerne og formerne linjer, der ikke danner et fuldstændigt kors. Præciplinjen krydser kun i én retning. Den udvidede nedbørslinje betegnes som en sporvogn. Sporen antyder, at antistoffet også udfælder en yderligere epitop, der ikke er til stede i et af antigenerne.
Dobbelt immunodiffusion kan også anvendes til semikvantitativ analyse af antigen eller antistof (figur 27.3):
Figur 27.3:
Dobbelt immunodiffusion til halvkvantitativ analyse af antigen. Antistof er anbragt i den centrale brønd, og antigenet placeres i forskellige koncentrationer i de perifere brønde
jeg. Kvantificering af antigen:
Antigenet X fortyndes serielt og anbringes i brøndene omkring en central brønd, i hvilken anti-X-antistof er anbragt. Antigenet og antistoffet diffunderer ud af brøndene og reagerer med hinanden, hvilket resulterer i dannelsen af bundfaldslinjer imellem antigen- og antistofbrøndene. Mængden af antigen-antistof-bundfaldet falder med faldende mængder antigener i de forskellige brønde. Derfor falder tykkelsen af bundfaldslinjerne, idet antigenkoncentrationerne falder.
ii. Kvantificering af antistof:
En fremgangsmåde svarende til kvantificering af antigen anvendes, bortset fra at positionen af antigen og antistof ændres. Antigenet placeres i den centrale brønd, og antistoffet ved forskellige fortyndinger placeres i de udvendige brønde.
Single Radial Immunodiffusion:
Mancini introducerede denne nye teknik til præcis kvantificering af antigener. Antistoffet blandes med smeltet agar og hældes i en petriskål. Efter størkning af agar skæres brønde og fyldes med forskellige koncentrationer af antigen (figur 27.4).
Antigen diffunderer ud af brønden og danner antigen-antistof-kompleksfældningen i 48-72 timer. Bundfaldet ses som en hvid cirkulær linje omkring hver brønd. Diameteren af den cirkulære ring er direkte proportional med antigenkoncentrationen (dvs. mere antigenkoncentrationen, bundfaldets diameter er mere).
En standardkurve kan plottet i et grafark ved at plotte de kendte antigenkoncentrationer i X-aksen og diametererne i Y-aksen. Testantigenet, hvis koncentration er ukendt, kan bestemmes ved interpolering af standardkurven med diameteren af bundfaldet dannet af testantigenet.
Sensibiliteten af denne metode er 1-3 μg / ml antigen. Denne metode anvendes til at kvantificere koncentrationerne af IgG, IgM eller IgA (ved inkorporering i henholdsvis agar anti-IgG, anti-IgM eller anti-IgA antisera).
