3 Klassifikationer af agglutinationsteknikker
Tre typer, hvori cellernes agglutinationsteknikker klassificeres, er: 1. Direkte agglutination, 2. Indirekte (passiv) agglutination og 3. Reverse (passiv) agglutination.
1. Direkte Agglutination Test:
Celler (såsom bakterier, svampe og erythrocytter) og uopløselige partikelformige antigener kan agglutineres direkte af deres specifikke antistoffer. Antistoffet har to Fab arme, med hvilke det kan binde til antigener på to celler. Ligeledes binder mange antistofmolekyler med et antal celler for at danne et gitter.
Denne gitterdannelse ses visuelt som klumper. Dermed indikerer dannelse af klumper tilstedeværelsen af antigen-antistof binding. Manglende agglutination indikerer fraværet af antigen-antistofreaktion.
Anvendelse af direkte agglutinationstest:
en. Identifikation af mikrober:
De bakteriekolonier, der dyrkes i dyrkningsmedier, identificeres ved anvendelse af kendt antisera mod mikrober. Det antimikrobielle antiserum, som frembringer synlig agglutination, identificerer bakterierne.
b. Diagnose af mikrobielle infektioner ved at detektere tilstedeværelsen af antistoffer mod mikrober i serum. Kendte mikrobielle antigener blandes med patientens serum, og forekomsten af agglutination indikerer tilstedeværelsen af serumantistoffer mod mikroben.
c. ABO blodgruppering af humane erythrocytter (ved anvendelse af antisera).
Agglutinationstestene udføres enten på objektglaset (glidemiddelagglutinationstest) eller i rør (røragglutinationstest).
jeg. Slide agglutination test er enkel og nem at udføre, og det kræver kun få minutter at udføre testen.
ii. Tubeagglutinationstest anvendes til at kvantificere mængden af serumantistoffer mod en mikrobe ved serielt fortynding af serumet og derefter blanding af den fortyndede serum med konstant mængde mikrobielle antigener. Efter passende inkubation tages højeste fortynding af serumet, der viser synlig agglutination, som serumets titer (for eksempel Widal-rørprøve, Brucella-rørprøve). Titeren afspejler koncentrationen af antistoffer i serumet; højere titer, mere er koncentrationen af antistoffer.
Slidetestene til detektion af serumantistoffer mod infektiøse midler anvendes som indledende screeningstest. Seraen af de positive glidetests skal testes ved hjælp af rørprøver for at bekræfte glidestestresultaterne. Slidtesten kan give vildledende resultater, især med meget høje serumantistofniveauer (fx prozonfænomen med brucella-antistoffer).
Der er meget iboende variabilitet i agglutinationstestsystemerne. Når serumtiterværdierne for en patient kontrolleres ved to lejligheder, er forskellen mellem titerværdierne signifikante, kun når titerværdierne varierer med mindst to dobbeltfortyndinger [eller forskel med to rør (fire gange den første værdi) ] (f.eks. i Widal-rørprøve fortyndes serumet i to fold: 1 i 20, 1 i 40, 1 i 80, 1 i 160, 1 i 320 og 1 i 640. Hvis en patient har en første Widal-test titer på 1 i 160, den anden Widal testtiter er signifikant, hvis den er 1 i 640 eller mere end 1 i 640.)
Heterophile antistof test:
(Ofte benævnt mono-spot test) Heterophil antistof test er en hæmagglutinationstest til påvisning af antistoffer mod Epstein Barr (EB) virus, der forårsager infektiøs mononukleose sygdom. IgM-antistofferne dannet under infektiøs mononukleose krydsreagerer med heste-RBC-overfladeantigener (sandsynligvis på grund af antigenisk lighed mellem EB-virus og heste-RBC-overfladeproteiner) og forårsager hæmaglutination.
Indirekte (passiv) agglutinationstest:
I den indirekte agglutinationstest belægges kendte opløselige antigener på andre celler (fx får eller kalkuner erythrocytter) eller inerte partikler (f.eks. Latex, bentonit, kul, polystyren), som virker som passive bærere af antigener.
Mange antigener kan overtrækkes direkte på erytrocytter eller efter behandling af erythrocytterne med formalin, tanninsyre eller glutaraldelyt. Fordelene ved at bruge erythrocytter til belægning er deres nemme tilgængelighed og opbevaringskapacitet. Desuden er disse test meget følsomme.
Testserum blandes med kendte antigenbelagte erytrocytter eller latex.
↓
Hvis testserumet har antistoffer agglutinerer erytrocytterne eller latexpartiklerne og producerer synlige klumper.
Hemagglutinationsassay:
Hemagglutinationstest er enkel og nem at udføre. Både kvalitative og kvantitative tests kan udføres med hæmagglutinationsteknik.
Testserumet fortyndes serielt i en fortyndingsopløsning i en mikrotiterpladebrønd.
↓
RBC'er overtrukket med et kendt antigen tilsættes i lige mængder til alle brøndene. Der anvendes passende positive kontrol-, negative kontrol- og reagenskontroller. Pladen rystes godt og inkuberes på et sted fri for vibrationer.
↓
Efter inkubationen læses pladen med de blotte øjne til agglutination.
Positive reaktioner:
Brønde med agglutination indikerer bindingen af antigenbelagte RBC'er med tilsvarende antistoffer i testserumet. Bunden af den agglutinerede brønd beskrives at have et tæppeudseende.
Negativ reaktion:
I brønde, hvor der ikke er nogen antigen-antistof binding, forekommer der ikke agglutination af RBC'er. På grund af tyngdekraften ligger RBC'erne ned til bunden af brøndene og giver en "knap" som udseende, hvor kanten af "knappen" er skarp og regelmæssig.
Antistof titer af testserum:
Serumfortyndingen, som giver 50 procent agglutination sammenlignet med brønden, der viser fuldstændig (100 procent) agglutination er antistoftiteren af testserumet. Hemagglutinationssæt er tilgængelige til antistofdetektion mod Hepatitis B-virus, HIV, thyroglobulin, etc.
Gelatinpartikelagglutination:
Gelatinepartikler er alternative til erythrocytter til partikelagglutinationstestene. Særlige gelatinepartikler (ca. 3 μm diameter) har en meget hydrofil overflade, og der er således ingen uspecifik binding af materialer, der er til stede i prøven. Gelatinepartikler fremstilles ved faseseparation og tredimensionel tværbinding ved 40 ° C. De resulterende partikler er fikseret med formaldehyd eller gluteraldehyd.
Gelatinepartikler har ingen antigenicitet og er derfor fri for problemerne forbundet med hæmaglutinationsassays (såsom heterofilantistofferne, der kan reagere ikke specifikt med RBC'er og give falskpositive agglutinationer i hæmagglutinationsassays).
Latex agglutination test:
Bortset fra erythrocytter og gelatine kan få andre partikler også bruges til at bære antigener på deres overflade. Sådanne antigenbelagte partikler vil agglutinere, når de blandes med specifikke antistoffer. Protein- og polysaccharidantigener kan overtrækkes på latexpartikler. Disse antigenbelagte partikler agglutinerer i nærvær af antistoffer.
Omvendt passivt hæmagglutinationsassay:
I revers passive hæmagglutinationsassays overtrækkes RBC'erne med kendte antistoffer. Disse kits anvendes til at detektere antigenerne i testprøverne, såsom HB s Ag i serumet.
Rose-Waaller Test:
Dette er en passiv hæmagglutinationstest for at detektere reumatoid faktor. Et af træk ved human reumatoid faktor er, at den kan binde med humant IgG såvel som kanin IgG. Får erythrocytter er overtrukket med subagglutinerende mængder af anti-får IgG antistoffer (hævet i kanin). De reumatoide faktorer agglutinerer får erythrocytter overtrukket med kanin anti-får IgG.
Flockningstest:
Flockning er en anden type antigen-antistof-kompleksdannelsesassay, der anvendes til at detektere og kvantificere antistofferne. I modsætning til agglutination og udfældning (hvor antigen-antistofkomplekserne sætter sig ned til bunden af røret) testes antigen-antistof-antistoffkomplekserne i flokkulering og forbliver i suspension som frikabler, og resultaterne læses under et mikroskop. Denne teknik anvendes i VDRL-test (kønssygdomsforskning laboratorietest) for at detektere antistoffer mod Treponema pallidum, de bakterier, der forårsager syfilis.
Viral hæmagglutination:
Viral hæmagglutination er en særlig kategori af erythrocytagglutination, som ikke involverer antigen-antistofreaktion. Visse vira binder til overfladeproteiner af RBC'er, og denne binding fører til spontan agglutination af RBC'er.
Den spontane agglutination af RBC'er med en virus kan forebygges af specifikke antivirale antistoffer. Antistofferne mod virus binder til virusoverfladeantigenerne og forhindrer interaktionen af virus og RBC'er, og derfor er RBC'erne ikke agglutinerede. Det kaldes viral hæmagglutinationsinhiberingsassay og bruges til at kvantificere virale antistoffer i patientens serum.
Test for kolde agglutininer:
Antistoffer dannet under visse infektioner (især Mycoplasma pneumoniae) og autoimmune sygdomme har en særlig evne til at agglutinere RBC'er ved 4 ° C. Disse antistoffer kaldes kolde agglutininer.
Seriefortyndinger af patientens serum inkuberes med 1% RBC'er ved 4 ° C natten over.
↓
Rørene undersøges for tilstedeværelsen af agglutination. Hvis agglutination er til stede reinkuberes rørene ved 37 ° C.
↓
Deagglutinering af RBC'er ved 37 ° C indikerer, at serumet har kolde agglutininer. Kold agglutininanalyse anvendes til at diagnosticere Mycoplasma pneumoniae infektion. 50 til 80 procent af akutte Mycoplasma pneumoniae-inficerede patienter har koldt agglutinin, der tilhører IgM-typen.
