Kliniske anvendelser af flowcytometer
Kliniske anvendelser af flowcytometer!
1. Opregning af forskellige celler (såsom T-celle og B-celler).
2. Påvisning af B-celleantigener og klassificering af hæmatopoietisk malignitet (leukæmier og lymfomer).
3. Påvisning af antigener på overfladen af myeloidceller, hvilket er nyttigt ved diagnosen myelodysplastiske syndromer og myeloid leukæmi.
4. CD34 molekyler er udtrykt på overfladen af hæmatopoietiske stam-progenitorceller. Stamceller isoleret fra knoglemarv eller perifert blod er opregnet ved at anvende mærkede mAbs til CD34, således at det nøjagtige antal stamceller kan beregnes og transfuseres til en patient. De resterende stamceller opbevares i flydende nitrogen og kan om nødvendigt transfusere til den samme patient.
5. HLA-fænotyping Fluorkrommærkede mAb'er for hver HLA-antigen anvendes til at binde med MHC klasse I og klasse II antigener på overfladen af celler. De farvede celler analyseres efterfølgende (idet cellerne passerer som en enkelt søjle) i flowcytometeret.
6. Påvisning af intracellulære antigener
Cellerne behandles først med midler, der gør cellen gennemtrængelig uden fuldstændig at bryde cellen.
↓
Bagefter behandles cellerne med milde konserveringsmidler for at forbinde de cytoplasmatiske proteiner på plads og forhindre dem i at lække ud af cellen.
↓
Derefter behandles cellerne med mærkede mAb'er rettet imod intracellulære antigener. De mærkede mAb'er indtræder cellerne og binder sammen med de intracellulære antigener.
↓
Cellerne ledes gennem flowcytometeret for at vurdere de farvede celler.
jeg. Påvisning af intracellulær terminal deoxynucleotidtransferase (TdT) hjælper med at definere tidlige B-celle-maligniteter. TdT er et enzym udtrykt under immunoglobulin-genomlægning, som er ansvarlig for tilsætningen af tilfældige nukleotider ved krydsningerne af immunoglobulinsegmenter. Derfor indikerer ekspression af TdT i en malign B-cellepopulation en meget umodentlig B-cellefænotype.
ii. Påvisning af intracellulær myeloperoxidase hjælper i klassificeringen af forskellige subtyper af myeloid leukæmi.
7. Analyse af DNA-indhold i celler. Flowcytometer kan vurdere mængden af genetisk materiale i en celle og bestemme S-fasefraktionen eller mængden af aneuploidi i en population af celler, a. DNA ploidi Normale celler, der indeholder to kopier af kromosom kaldes diploide celler.
Alle celler (undtagen æg og sæd), der ikke er diploide, betragtes som aneuploid og kan tjene som en pålidelig indikator for neoplasi. Et stort antal celler i en tumor har en afvigende mængde DNA. Flowcytometrisk DNA-analyse udføres ved inkubering af permeabiliserede celler med fluorescerende farvestoffer (såsom propidiumiodid).
Farvestoffet interkalerer i DNA og fluorescerer. Mængden af fluorescens er direkte proportional med cellens DNA-indhold. Effektiviteten af kemoterapi til malignitet hos en patient kan vurderes ved ploiditetsanalyse. Ploidy-analyse bestemmer den samlede mængde af nukleært DNA i individuelle tumorceller. DNA-indekset er forholdet mellem DNA-fluorescens af tumorcelle og DNA-fluorescensen af normal celle. DNA-indekset for den normale diploide celle er 1. DNA-indeks på mere end mindre end 1 indikerer en aneuploid tumor.
b. DNA-cellecyklusanalyse:
DNA-indholdet i celler ved forskellige cellecyklusfaser under replikation (dvs. Gq / Gj-fase-DNA-syntesefase; S-fase-DNA-syntese; G2 / M-fase-DNA-syntesefase) kan måles for at vurdere cellevækst og kræft aggressivitet. Mere DNA syntetiseres af aggressive kræftceller. Celler, der går gennem S-fasen, viser DNA-syntese, som er direkte proportional med deres aggressivitet.
8. Mange leukocytfunktionelle assays kan udføres med flowcytometer.
jeg. Fremstilling af O2 - (superoxid) som et assay for kronisk granulomatøs sygdom.
9. Påvisning af celle levedygtighed:
Farvestoffet propidiumiodid går ind i celler, der har ødelagte membraner og en forstyrret nuklear struktur. Derfor vil der med propidiumiodid fluoresceres, mens levende celler ikke fluorescerer. Desuden er fluorescensen af propidiumiodid i den langt røde del af spektret. Derfor kan denne fremgangsmåde kombineres med regelmæssig mAb-farvning, hvor de døde celler er farvede rød og derfor kan udelades fra dataanalysen.
10. Flowcytometriske metoder til at detektere celler, der gennemgår apoptose, er også tilgængelige.
