Spore-farvning af bakterier til differentiering af bakteriel spor og vegetativ celle

Formål:

Alle bakterier forbliver i deres 'vegetative former', hvis miljøbetingelserne er gunstige for deres normale metaboliske aktiviteter.

I denne form tager de næringsstoffer op, vokser og reproducerer.

På den anden side dør de fleste af dem, når miljøforholdene bliver negative, såsom alvorlig forkølelse, ekstrem varme, aldring, mangel på næringsstoffer, udsættelse for stråling og giftige kemikalier.

Imidlertid kan få arter af bakterier overleve under sådanne ugunstige forhold ved at skifte sig til meget resistente, metabolisk inaktive former kaldet 'sporer'. Under ugunstige forhold produceres en spore i en vegetativ celle ved dehydrering og sammentrækning af dets celleindhold.

Denne spore, der er dannet inde i bakteriecellen, kaldes 'endospore' (figur 2.13). Hvis uønskede tilstande forværres, bryder cellen, frigiver endosporen, som nu bliver en uafhængig sovende celle kaldet 'spore'.

Sporedannelsesprocessen kaldes 'sporogenese'. Sporet har tykke, relativt uigennemtrængelige lag, såsom spore cortex og spore coat, som beskytter cellen mod enhver fysisk skade. Sporen får sin modstand ved flere mekanismer, som endnu ikke er tydeligt forklaret.

Når betingelserne bliver gunstige, giver lagene, der dækker sporebruddet og sporet, en metabolisk aktiv vegetativ celle. Denne proces kaldes 'spiring'.

På basis af evnen til at danne sporer kan bakterier således opdeles i to grupper som følger:

(1) Spordannende bakterier (Sporeformere):

En bakterie, der kan producere en spore for at overleve under ugunstige miljøforhold, er en sporeformende bakterie (spore-former). For det meste kan de følgende tre slægter af stangformede bakterier producere sporer under ugunstige miljømæssige forhold.

A. Aerobe stangformede bakterier

1. Bacillus spp.

B. Anaerob stangformede bakterier

2. Clostridium spp.

3. Desulfotomaculum spp.

(2) Ikke-sporeformende bakterier (ikke-sporeformere):

En bakterie, der ikke kan producere en spore og derfor dør i sin vegetative form under ugunstige miljøforhold, er en ikke-spordannende bakterie (ikke-sporeformet).

Formålet med sporefarvning er at differentiere sporer og vegetative celler i en sporeformator og at differentiere sporeformere fra ikke-sporeformere. Sporefarvning er også nyttig ved identifikation af bakterierne, der tilhører slægten Bacillus, Clostridium og Desulfotomaculum.

Princip:

Sporerne er forskellige fra de vegetative celler, idet de har tykke, relativt uigennemtrængelige lag omkring dem (figur 2.14). Den primære plet, malachitgrøn, kan ikke trænge ind i sporerne gennem disse lag.

Derfor er penetrationen af den primære plet forstærket ved anvendelse af varme, som driver den gennem dæklagene ind i spore protoplast. Nu er sporerne grønne. Når sporerne behandles med affarvningsmidlet, skal man trykke vand, de undergår ikke affarvning, da de udelukker vand.

Vandhanen fjerner kun den overskydende primære plet, der er til stede i spores omgivelse. Sporerne bevarer således den grønne farve. Efterfølgende, når modfarvning med safranin, kan safraninmolekylerne ikke komme ind i sporerne gennem dæklagene. Således beholder sporene endelig den grønne farve af den primære plet og virker grøn.

På den anden side optager de vegetative bakterieceller først den primære plet, malachitgrøn, men pletten har ikke stærk affinitet for vegetative cellekomponenter, hvorfor den vaskes væk, når de affarves under ledningsvand.

Nu er de vegetative celler farveløse. Når de farvefarves med safranin, tager de farveløse vegetative celler op pletten og bliver rød i modsætning til sporerne, som synes grønne.

Materialer krævet:

Slide, sløjfe, malachitgrøn, safranin, sporeformende bakterier, varmeplade, mikroskop, nedsænkningsolie.

Procedure:

1. Et objektglas rengøres ordentligt under vand fra vandet, således at vand ikke forbliver som dråber på overfladen.

2. Det klæbende vand udslettes med bibulous papir og glideren lufttørres.

3. Et smear af sporeformende bakterier fremstilles i midten af et objektglas i to metoder som angivet nedenfor.

(en) Hvis der observeres sporeformer vokset på agarplade eller agarskråning, placeres en dråbe vand i midten af glideren. En sløjfe steriliseres over flammen, og en Clostridium-sløjfe af bakterier fra en alderen plade eller skråkultur (48-72 timer gammel) af sporeformer, såsom Clostridium supergener eller Bacillus subtilis, overføres til vandfaldet.

Derefter foretages en bakteriesuspension ved forsigtig drejning af sløjfen i vandfaldet, og dråben spredes, indtil et smear opnås. Efterhånden som sporeformende bakteriers alder på plader eller skråkulturer øges, danner de sporer.

(B) Hvis sporeformet dyrket i flydende bouillon skal overholdes, udsættes bouillonkulturen, der kun indeholder vegetative celler, på varmestrøm ved opvarmning på et vandbad i 15 minutter, således at nogle af de vegetative celler danner sporer for at overvinde varme stress. En dråbe af den blandede spor-vegetative cellesuspension fra bouillonkulturen placeres direkte i midten af glideren ved hjælp af en steril sløjfe, og et smear fremstilles ved spredning.

4. Smøret er lufttørret.

5. Smøret fastgøres ved opvarmning. Opvarmning resulterer i koagulering af de cellulære proteiner, hvoraf cellerne holder sig til glidens overflade og ikke vaskes væk under farvning. Varmefiksering sker ved hurtigt at føre glideren højt over en flamme 2-3 gange med smøret Overfladen vender opad, så smøret ikke bliver opvarmet.

6. Smøret er oversvømmet med den primære plet, malachitgrøn.

7. Glideren holdes på en varm kogeplade, og forberedelsen får lov til at dampe i 2-3 minutter. Temperaturen på varmepladen er således justeret, at kogeproduktionen ikke koger og hurtigt fordampes. Fordampningstabet genopfyldes, så smøret ikke bliver tørret op.

8. Glideren fjernes fra varmepladen og afkøles.

9. Smøret er affarvet ved vask under forsigtigt flydende ledningsvand, således at vand ikke falder direkte på smøret.

10. Smøret er oversvømmet med modfarven, safranin i 30 sekunder.

11. Overskydende pletter vaskes helt væk fra smøret under forsigtigt strømning af ledningsvand på en sådan måde, at vand ikke falder direkte på smøret.

12. Glideren blottet tørt med bibulous papir.

13. Glideren klipses til mikroskopets stadium og smøret observeres under lavt strømforbrug og højt tørre mål.

14. En dråbe nedsænkningsolie sættes på smøret.

15. Smøret er observeret under olie-nedsænkningsmål.