Western blotting af proteiner
Western Blotting of Proteins!
Proteiner denatureres ved inkubering med et ionisk detergent (SDS: natriumdodecylsulfat) ved 100 ° C.
SDS overtrækker alle proteinerne ensartet og gør overfladen af proteinerne negative.
↓
Det denaturerede protein elektrofores derefter i polyacrylamidgel. Proteinerne adskilles som forskellige bånd afhængigt af deres molekylvægte.
↓
De separerede proteiner er elektroforetiske allieret overført til et filterpapir (nylon eller nitrocellulose).
↓
Filterpapiret inkuberes derefter med antisera mod proteinerne. Antistofferne binder til deres tilsvarende proteinantigener på filterpapiret og danner antigen-antistofkomplekser.
↓
Filterpapiret vaskes for at fjerne ubundne serumkomponenter.
↓
Enzymmærket anti-immunoglobulin (kendt som konjugat) tilsættes til filterpapiret og inkuberes.
↓
Konjugatet binder til antistoffet i antigen-antistofkomplekset i filterpapiret.
↓
Filterpapiret vaskes for at fjerne ubundet konjugat, og substrat tilsættes og inkuberes.
jeg. Farvede bånd udvikler sig på steder, hvor der er antigen-antistofkomplekser.
iii. Ikke-udvikling af bånd antyder, at det tilsvarende antistof mod antigenet er fraværende i testserumet.
Filterpapirene imprægneret med antigener kan opbevares i længere perioder.
Western blot-analysen anvendes i vid udstrækning til at detektere hepatitis C-virusantistoffer og som en bekræftende test for påvisning af antistoffer mod human immunodeficiencyvirus (HIV).
Erhvervsvirksomheder imprægnerer filterpapir med adskilte HIV-antigener og leverer til laboratorierne. I laboratoriet sættes patientens serum til filterpapiret og behandles for at detektere tilstedeværelsen af HIV-specifikke antistoffer i serumet.
radioimmunoassay:
Radioimmunoassay (RIA) blev først udviklet af Rosalin Yalow og Berson (1959). Talrige variationer i metoden er indført. Der er to vigtigste RIA teknikker, konkurrencedygtige RIA og noncompetitive RIA.
Forskellige radioisotoper anvendes som etiketter (tabel 27.4), og de radioaktive emissioner måles i forhold til tæller pr. Minut (CPM) ved hjælp af scintillationstæller. Den mest populære label, 125 Jeg kræver en kortere tid til signalregning, men den har en begrænset holdbarhed på grund af den korte halveringstid. Tritium ( 3 H) radioisotop kræver længere tid til tælling, og dermed øges den samlede analysetid.
Fordelene ved RIA er:
jeg. Præcision og høj kvalitet
ii. Isotopforbindelse er let
iii. Signaldetektion uden optimering
Tabel 27.4: Egenskaber for radioisotoper anvendt i radioimmunoassay:
isotop | Halvt liv | Type forfald | Specifik aktivitet (mCi / μmol) |
125 I | 60 dage | γ | 2200 |
131 I | 8, 1 dage | Β-, γ | 16.100 |
3 H | 12, 3 år | β- | 29 |
14 C | 5760 år | β- | 6062 |
32 s | 14, 3 dage | β- | 9120 |
RIA har imidlertid følgende ulemper
jeg. Kort halveringstid af reagenser
ii. Fare for radioaktivitet.
