Nyttige noter om lymfocytaktiveringsassays
De funktionelle kapaciteter af lymfocytter som svar på antigener eller mitogener bestemmes ved hjælp af lymfocytaktiveringsassays.
Derfor er lymfocytaktiveringsassays mere hensigtsmæssige til at vurdere individets immunokompetence end en simpel opregning af lymfocytter.
Der er to typer lymfocytaktiveringstest:
jeg. Påvisning af 'aktiveringsmarkører' på lymfocytoverfladen.
ii. Vurdering af lymfocyternes evne til at proliferere efter T-celle stimulering.
De mest almindeligt anvendte T-celle-stimuli til vurdering af T-lymfocytproliferation er:
jeg. Lectiner [såsom phytohemagglutinin (PHA) og concanavalin A (ConA)
ii. Bakterielle toksiner, der virker som superantigener
iii. Kemiske forbindelser [såsom phorbal myristatacetat (PMA), calciumionophorer
iv. cytokiner
v. mAbs til overfladereceptorer (især CD3-molekyler på T-celler)
B-celleaktivering induceres af:
jeg. Pokeweed mitogen (PWM). PWM aktiverer også T-celler
ii. Super antigener
iii. lipopolysaccharider
iv. mAb'er, der krydser link på B-celleoverfladen.
en. Oprensede lymfocytter dyrkes i 96 brønde mikrotiterbrønde og stimuleres med antigen eller mitogen (normalt i 48 timer).
↓
Tritieret thymidin (3H-Tdr) tilsættes til brøndene og inkuberes
↓
Indholdet af brøndene suges igennem og filtreres på filtre, og mængden af 3 H Tdr i filterpapiret måles. Inkorporering af 3 H-Tdr i kromosomalt DNA afspejler celleproliferation.
b. Der er ikke-radioaktive analyser til bestemmelse af proliferationen af celler. Disse analyser anvender fluorescerende farvestoffer, der inkorporerer i DNA eller farvestoffer, der måler oxidativ respiration, såsom MTT.
c. Bromodeoxyuridin (BrdU) inkorporeres i DNA'et af stærkt replikerende celler og kan derfor anvendes til at vurdere celleproliferation. Den indbyggede BrdU i celler detekteres ved anvendelse af mAb'er mod BrdU og flowcytometri (som påvisning af intracellulære antigener ved hjælp af flowcytometri).
BrdU kan også administreres til cancerpatienter in vivo, og senere kan tumoren resekteres, og tumorcellerne kan vurderes for inkorporering af BrdU. Dette assay tilvejebringer en ide om den proliferative fraktion af tumorceller i en patient.
d. Cytotoksisk T-celleaktivering analyseres ved 51 kromfrigivelsesassay:
Målceller mærkes med radioaktivt krom ( 51 Cr), der binder til intracellulære proteiner fra målcellerne.
↓
De mærkede målceller inkuberes med cytotoksiske T-celler.
↓
Målcellelys ved de cytolytiske T-celler resulterer i frigivelsen af 51 Cr.
Cellerne centrifugeres, og den frigivne 51 Cr i supernatanten måles. Mængden af frigivet 51 Cr er proportional med lysis af celler.
