Neutrofilfunktionsanalyser
Neutrofile funktionsanalyser!
1. Kemotakse af neutrofiler kan vurderes ved hjælp af følgende metoder:
en. Modificeret Boyden kammer assay:
Boyden kammeret består af et øvre og et nedre kammer adskilt af et filter med lille porestørrelse.
Neutrofil suspensionen placeres i det øvre kammer, og et kemotaktisk stof anbringes i det nedre kammer. Graden af neutrofilmigration vurderes ved at tælle antallet af neutrofile fanget i filteret og antallet af neutrofiler i det nedre kammer ved hjælp af flowcytometri.
b. Wells er udstanset i en halvfast agar:
Neutrofil suspension, kemotaktisk stof og et ikke-kemotaktisk stof anbringes i forskellige brønde. Migrering af celler gennem den halvfaste agar mod det brønd indeholdende kemotaktiske stof bestemmes mikroskopisk. Migration over for det ikke-kemotaktiske stof repræsenterer godt den tilfældige bevægelse af celler (kendt som chemo kinesis).
2. Neutrofile fagocytose:
En række partikler kan anvendes til at vurdere neutrofilernes fagocytiske kapacitet. Partiklerne inkuberes med neutrofiler og senere observeret mikroskopisk for tilstedeværelsen af partiklerne inde i neutrofilerne. De celleoverfladebundne partikler fjernes ved syrebehandling, således at de celleoverfladebundne partikler ikke tælles som intracellulære partikler.
Fluorescerende mærkede eller radioaktive partikler, som tillader direkte tælling af partikler af fagocytter, er også nu tilgængelige.
3. Bestemmelse af åndedrætsudbrud og degranulation:
Kronisk granulomatøs sygdom (CGD) er en immundefektsygdom, hvor den intracellulære dræbning af phagocytter påvirkes på grund af manglende evne til fagocytiske celler til at fremstille superoxidanion (O2-).
en. Nitroblue tetrazolium (NBT) glidetest:
NBT er et klart, gult, vandopløseligt farvestof. NBT reduceres til en dyb blå, formazon med O 2 - . Neutrofile aktiveres ved behandling med PMA eller eksponering for LPS. De aktiverede neutrofiler inkuberes derefter med NBT. Hvis neutrofile producerer O 2 - reduceres NBT til dybblåt formazon, og det visualiseres under mikroskop. Et kvantitativt assay kan udføres ved ekstraktion af formazonen fra neutrofilerne og analyse af formazonen med et spektrofotometer. Børn med fuldstændig mangel på NADPH-oxidaseaktivitet viser en brutto mangel i NBT-testen. Men børn med delvis tab af NADPH-oxidaseaktivitet detekteres bedre ved kvantitativ analyse.
b. Flowcytometrisk assay under anvendelse af 2'7'-dichlorfluorescein (DCF):
Den O2 - dannede under NADPH-oxidaseaktivitet omdannes til H202 med enzymsuperoxiddismutasen. H202 er en anden mikrobicid kemikalie. H202 oxiderer den ikke-fluorescerende forbindelse DCF til en fluorescerende forbindelse, som detekteres af flowcytometeret.
Phagocytter inkuberes med DCF, og DCF går ind i cellerne.
↓
Derefter aktiveres neutrofilerne af PMA eller andre midler.
↓
Derefter analyseres cellerne i flowcytometeret. En stigning i phagocyternes florescens bestemmes.
Flowcytometer tillader også den kvantitative bestemmelse af H202 produceret af individuelle celler. Således er flowcytometrisk analyse nyttig ved påvisning af partielle defekter i NADPH-oxidasefunktion eller til screening for heterozygote bærere af den X-bundne form af CGD.
4. Fagocyt degranulation:
Phagocytisk degranulation er en proces med fusion af lysosomer med fagosomer, hvilket fører til udledning af lysosomale indhold i fagolysosomet. Degranulation er en aktiv proces og kræver energi. Nedsættelsen af neutrofilernes normale metaboliske veje (især iltforbrug og glukosets køddannelse gennem hexose monophosphat shunt) interfererer med degranulation; Følgelig påvirkes intracellulær dræning af mikrober af fagocytterne.
Degranulering af fagocytter i en suspension kan induceres af forskellige aktiviseringsmidler og forbindelser, som påvirker cytoskeletten i cellen (såsom cytochalasin B). Fagocytterne frigiver hovedsageligt de sekundære og tertiære granuler, og de måles ved hjælp af ELISA-metoder.
jeg. Lactoferrin (et sekundært neutrofilt granulat) anvendes som en markør for sekundær granulfrigivelse.
ii. Albumin analyseres som et mål for tertiær granulfrigivelse.
Assay for primærgranulatfrigivelse fra phagocytter udføres ved at kigge efter frigivelse af primære granulater i lukkede rum. "Frustreret fagocytose" er et assay anvendt til at vurdere frigivelsen af primære granuler (figur 27.7).
Varme aggregerede immunglobulin eller immunkomplekser er fastgjort til et petridish.
↓
Neutrophils tilsættes til petridish og inkuberes. Gennem deres Fc-receptorer binder neutrofilerne til Fc-regionerne af varmeaggregerede immunoglobulin eller immunkomplekser. Følgelig forsøger neutrofilerne at fagocytose de varmeaggregerede immunoglobulin eller immunkomplekser. Men neutrofilerne kan ikke fagocytose dem (fordi de er fikseret til petriskålen). Følgelig frigiver neutrofilerne deres granulære indhold over dem.
↓
Hastigheden for frigivelse af primære granulproteiner, såsom myeloperoxidase eller p-glucoronidase, anvendes til at estimere degranuleringen. Mangler ved syntese af primære / sekundære granuler kan også detekteres ved farvning af intracellulære granulater med mærkede mAbs og flowcytometri.
Bakteriel drab af neutrofiler:
Mikrobicide analyser er vanskelige at udføre. Generelt udføres mikrobicide analyser, når mere simple analyser ikke giver tilstrækkelig information.
Staphylococcus aureus stamme 502A anvendes almindeligvis til at vurdere neutrofilernes mikrobicide kapacitet.
Staphylococcus aureus stamme 502A vokser i logfase inkuberes med humant sera (for at tilvejebringe immunoglobulin og komplementproteiner til at virke som opsoniner).
↓
Fersk isolerede neutrofiler tilsættes i en koncentration på 5-10 bakterier / neutrofil.
↓
Efter 30 minutters inkubering dræbes bakterierne, der ikke brydes af neutrofilerne, ved tilsætningen af lægemiddel gentamicinet. (Gentamidn indtræder ikke i neutrofiler og dermed fagbevoktede bakterier forbliver i live.)
↓
Alkvoter af neutrofiler fjernes med 30 minutters intervaller og blandes med sterilt destilleret vand for at lyse neutrofilerne og frigive bakterierne. Antallet af levedygtige bakterier i hver alikvot måles ved seriel fortynding af og plating på blodagarplader.
↓
Resultaterne er afbildet på en graf.
jeg. Normale neutrofiler viser en to-log reduktion i levedygtige intracellulære bakterier efter en times inkubation.
ii. Næsten er der ingen drab af neutrofiler fra homozygote CCD patienter.
iii. Neutrofiler fra heterozygote CGD-bærere viser partielt drab af neutrofilerne.
