Immunofluorescens anvendt til påvisning af antigener i celler
Immunofluorescens anvendt til påvisning af antigener i celler!
Fluorescerende forbindelser som immunokemiske til påvisning af antigener i væv blev introduceret af Coons (1941).
Immunofluorescens anvendes til påvisning af antigener i celler eller væv (ved anvendelse af kendte antistoffer) såvel som påvisning af antistoffer i serum (ved anvendelse af kendte antigener). Fluorescens er emission af lys af en farve, når stoffet er udsat for et lys af en anden farve. Når et fluorescerende stof er spændt med et lys med særlig bølgelængde absorberer den lyset og udsender et lys af en anden bølgelængde.
jeg. Fluoresceinisothiocyanat (FITC) har et absorptions maksimalt lys ved 490-495 nm, og det udsender lyset ved 530 nm (grøn farve).
ii. Tetramethyl rhodamin isothiocyanat har en maksimal lysdæmpning ved 550 nm og udsender rødt lys (580 nm).
en. Direkte immunfluorescens:
Denne teknik bruges til at detektere antigener i celler eller væv.
Vævet, som har ukendt antigen, er fastgjort til en glasskinne.
↓
Kendt antiserum (specifikt for antigenet af interesse) konjugeret til FIT (kendt som konjugat) lages på vævet og inkuberes.
jeg. Hvis antigenet af interesse er i vævene binder konjugatet til antigenet.
↓
Derefter vaskes lysbilledet for at fjerne det ubundne konjugat.
↓
Lysbildet ses derefter under fluorescerende mikroskop.
jeg. Lys grøn farve vil ses, hvis der er antigen i vævet.
ii. Hvis der ikke er noget antigen i vævet, ville alt konjugatet have været vasket under vaskesteget, og der er derfor ingen grøn farve.
Denne teknik anvendes også til at detektere tilstedeværelsen af bakterielle eller virale antigener i inficerede væv.
b. Indirekte immunfluorescens:
Denne teknik bruges til at detektere antistoffer i serum.
Celler indeholdende kendte antigener er fastgjort til glasskinner.
↓
Testserumet tilsættes over diaset og inkuberes.
jeg. Hvis der er antistoffer (mod antigenerne i celler) i serum, binder antistofferne til antigenerne i celler.
↓
Derefter vaskes objektivet for at fjerne de ubundne serumkomponenter.
↓
Anti-humant immunglobulin konjugeret til FITC tilsættes og inkuberes.
jeg. Det FITC-konjugerede anti-humane immunoglobulin vil binde til serumantistofferne bundet til celleantigenerne.
↓
Efter vask ses lysbildet under fluorescerende mikroskop.
jeg. Tilstedeværelse af lysegrøn farve indikerer, at serumet har antistoffer mod antigenerne i cellerne.
ii. Fravær af grøn farve indikerer fraværet af serumantistoffer mod antigenerne i de anvendte celler.
