HLA: Histokompatibilitetstestmetoder

Histokompatibilitetstestmetoder!

HLA-systemet er omfattende polymorf. Den polymorfe karakter af HLA alleler blev oprindeligt fundet og defineret ved serologiske metoder, og HLA antigenerne blev givet tal. Senere blev det konstateret, at antigener med samme serologiske specificitet kan have forskellige aminosyresekvenser. I 1999 oversteg antallet af kendte HLA alleler 1000, og antallet er stadig stigende. På grund af den omfattende polymorfisme er nomenklaturen for HLA alleler kompleks, og det er også svært for en person at forstå nomenklaturen, medmindre personen er i histocompatibility feltet.

De første sekventerede alleler blev tildelt navne med to cifre, der svarede til deres serologiske specificitet. De to første cifre efterfølges af yderligere to cifre, der angiver den kronologiske rækkefølge for navngivning af WHO-nomenklaturkomiteen for faktorer i HLA-systemet. (For eksempel. Den første allel sekventeret fra et HLA-A2-gen blev betegnet HLA-A 0201, og den anden allel sekventerede blev navngivet HLA-A 0202.)

HLA-typing udføres ved serologiske typemetoder eller molekylære maskinskrivningsmetoder. De serologiske HLA-typemetoder detekterer epitoperne af HLA-molekylerne, medens de molekylære metoder detekterer nukleotidsekvenserne.

jeg. HLA-typing, der definerer grupper af alleler (normalt tilnærmende serologiske specifikationer) kaldes lav opløsning eller generisk typing (for eksempel HLA-DRBl-04).

ii. Indtastning af denne løsning alle kendte alleler kaldes HLA-typing med høj opløsning (for eksempel HLA-DR BI x401).

iii. Typing der løser ud over serologiske specifikationer, men der ikke opnår alleliveau, betegnes som mellemopløsningstyping (for eksempel HLA-DRBl-0401/09/13/16/21/26/33).

National Marrow Donor Programmet har oprettet kode for at lette styringen af ​​disse komplekse mellemliggende opløsningsdata. I dette system er navnet på HLA-BRBl-0401/09/13/16/21/26/23 / DRBl-04EJV.

Histokompatibilitetstest ved serologiske metoder:

Lymfocytter anvendes til serologisk HLA-typing, antistof screening og cross matching.

Isolering af lymfocytter til HLA-typing:

jeg. Perifert venøst ​​blod blandes med Ficoll-Hypaque og centrifugeres. Laget indeholdende perifere blodmononukleære celler aspireres, vaskes og anvendes.

ii. Lymfocytter isoleret fra lymfeknuder og milt af cadavers anvendes.

iii. HLA-typing til klasse II-antigener udføres med berigede B-cellepopulationer (Ca. 80 procent af normale perifere blod-T-celler hviler T-celler, der mangler klasse II-antigener på deres overflade).

iv. Anti-CD2 eller anti-CD3 mAbs-belagte magnetiske perler anvendes til at isolere T-celler; og anti-CD19 mAbs-belagte magnetiske perler anvendes til at isolere B-celler.

Påvisning af HLA-antigener af lymfocytter:

Mikrocytotoksicitetsassay er et komplement-afhængigt lymfcytotoksicitetsassay. Frosne typebakker, der indeholder brønde overtrukket med forskellige antistoffer mod HLA-antigener, er kommercielt tilgængelige.

Ca. 2000 lymfocytter dispenseres i hver brønds brønd og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. (Antistoffer i hver brønd binder til specifikke HLA-antigener på overfladen af ​​lymfocytter, hvis de er til stede.)

↓

Fem μl komplement (sædvanligvis kaninserum) tilsættes til hver brønd og inkuberes i 60 minutter (komplementproteiner forårsager død af lymfocytter, der er overtrukket med mAbs. I fravær af mAb-binding med lymfocytter aktiveres komplementet ikke, og lymfocytterne er ikke dræbt).

↓

Farvestoffet E, efterfulgt af formaldehyd (formaldehyd fixerer reaktionen) tilsættes.

↓

Derefter tælles de døde celler og levende celler i hver brønd under et fasekontrastmikroskop.

jeg. Hævede og mørke celler er døde celler (Farvestoffet E går ind i døde celler).

ii. Lyse og refraktile celler er levende celler (Farvestoffet E går ikke ind i levende celler).

Hver brønd i bakken ses individuelt for døde celler og levende celler. Procentdelen af ​​døde celler i hver brønd beregnes, og scoringen foretages som i tabel 27.5.

Tabel 27.5: Scoring af lymfecytotoxicitetstesten for HLA:

HLA-typen af ​​et individ bestemmes ved fortolkning af reaktionen af ​​individets lymfocytter med forskellige antisera anvendt i den komplementafhængige lymfcytotoksicitetstest.

jeg. Hvert individ forventes at have to HLA-A, to HLA-B og to HLA-C antigener på overfladen af ​​lymfocytter.

ii. Hvis en person kun viser én HLA-A eller HLA-B eller HLA-C antigener i testen, er sandsynligvis det pågældende individ homozygot for det pågældende antigen, eller det antisera panel, der anvendes i testen, har ikke det specifikke antistof mod den anden antigen eller der er lav ekspression af HLA-molekyler på lymfocytoverfladen.

Den komplementafhængige lymfcytotoksicitetsanalyse for HLA-DR- og HLA-DQ-antigener udføres ved anvendelse af B-celler isoleret af mAB-belagte magnetiske perler eller B-celler isoleret over nylonuld.

De fleste af HLA-typesera er opnået fra flerfarvede kvinder. Da de mutioparøse kvinder gentagne gange udsættes for fosterernes HLA-antigener, har sera fra de multiparøse kvinder antistoffer mod HLA-antigener. Næsten 200 forskellige antisera bruges til at skrive et individs HLA-antigener.

Det blev oprindeligt antaget, at mAbs til hvert af HLA-antigenet kunne udvikles, og HLA-typing ville være enkelt. Men mange mAbs binder sig til de fælles epitoper snarere end til de private epitoper af HLA antigenerne. Endvidere fastsætter mange murine mAb'er ikke komplement (og derfor er deres anvendelse i komplementafhængige lymfcytotoksicitetsassays begrænset).

Imidlertid kan murine mAb'er anvendes i ELISA-metode og flowcytometri-metode, som ikke kræver komplement. For sent foretrækker mange laboratorier at anvende molekylær HLA-typing, snarere end serologisk HLA-typing.

Screening af transplantagruppens serum til antistoffer mod l-ILA-antigener (antistof screening):

Tilstedeværelsen af ​​antistoffer mod HLA-antigener i serum af en ventende organtransplantationsmodtager udføres sædvanligvis ved hjælp af komplementafhængig lymfecutotoksicitet. Lymfocytter med kendte HLA antigener og komplement blandes med modtagerens serum. Efter passende inkubation tælles de døde lymfocytter og levende lymfocytter. Det procentvise panelreaktive antistof (PRA) beregnes derefter.

PRA = Antal positive celler / Antal samlede panelceller x 100

PRA angiver omfanget af sensibilisering af den ventende modtager til HLA antigener.

ELISA Metode til Screening Serum HLA Antistoffer:

ELISA-metoden er let, hurtig og kræver ikke levende lymfocytter samt komplement. Affinitetsrensede HLA-antigener er belagt på væggene i mikrotiterpladen

↓

Modtagerens serum tilsættes og inkuberes

↓

Efter vask tilsættes enzymkonjugeret anti-humant IgG og inkuberes.

↓

Efter vask tilsættes substrat og inkuberes.

jeg. Udvikling af farve i en bestemt brønd indikerer tilstedeværelsen af ​​IgG-antistoffer mod HLA-antigenet, der er belagt på den pågældende brønd.

ii. Ikke-udvikling af farve i en bestemt brønd indikerer fraværet af antistoffer mod det bestemte HLA-antigen overtrukket på den brønd.

Flowcytometer til påvisning af serum HLA-antistoffer:

Mikroperler belagt med HLA-antigener inkuberes med patientens serum og derefter med fluorescerende mærkede anti-humane IgG-antistoffer. Den procentdel af perler, der pletter over baggrunden, giver måling af patientens procentvise panelreaktive antistoffer (PRA).

Cross Matching:

Hvis blod fra en ventermodtager indeholder antistoffer mod donor-HLA-antigenerne, vil HLA-antigenerne på donorcellerne blive angrebet af modtagerens antistoffer ved transplantation. Derfor er det vigtigt inden transplantationen at vide, om modtageren har antistoffer mod donor-HLA-antigenerne.

Hvis donor HLA-antigenspecifikke antistoffer er til stede i modtagerens serum, vil transplantationen afvises. Kryds matching er gjort for at detektere tilstedeværelsen af ​​ventermodtagerens serumantistoffer mod de foreslåede donor-HLA-antigener.

Lymfecytotoksicitet Kors, der passer til perifert blodlymfocytter:

Perifert blodlymfocytter af den foreslåede donor (som ca. indeholder 80 procent T-celler (som bærer MHC klasse I antigener) og 20 procent B-celler og monocytter (som bærer MHC klasse I og klasse II antigener) blandes med den ventende recipient's serum og inkuberes .

↓

Komplement tilsættes og inkuberes.

↓

Farvestoffet E er tilsat og inkuberet.

jeg. Antallet af døde og levedygtige celler tælles og procentdelen af ​​døde celler beregnes. 50 procent eller mere celledød indikerer en stærk positiv krydskamp (dvs. modtagerens serum har antistoffer, der er i stand til at reagere med donor HLA-antigener). En stærk positiv krydskamp mellem en modtager og en foreslået donor er en kontraindikation for organtransplantation fra donor til modtager.

For at finde ud af om recipientens antistoffer er rettet imod antigenerne i klasse I eller klasse II, er der foretaget henholdsvis T-celle lymfcytotoksicitet kryds-matching (ved anvendelse af beriget T-celler) eller B-celle lymfcytotoksicitet-kryds-matching (ved hjælp af berigede B-celler).

Flowcytometer-kryds-matching er 30-250 gange mere følsom end de visuelle serologiske metoder til påvisning af IgG-antistoffer mod HLA-antigener på overfladen af ​​lymfocytter.

Perifert blodlymfocytter af den foreslåede donor inkuberes med mærket (for eksempel et fluorescerende farvestof, der udsender grønt lys) anti-CD3 mAb'er, som binder til T-celler.

↓

De mærkede ani-CD3-bundne T-celler separeres fra B-celler i flowcytometeret.

↓

De adskilte, farvede T-celler inkuberes nu med den ventende modtagers serum.

jeg. Modtagerens serumantistoffer mod donor-T-celle-HLA-antigener, hvis de er til stede, vil binde til T-cellerne.

↓

Efter vask er en flurochrom (der udsender en anden farve end grøn, rød farve) mærket anti-humant IgG tilsat og inkuberet.

ii. Det florochrommærkede anti-humane IgG vil binde til modtagerens HLA-antistoffer, som er bundet til donor-T-cellerne.

Flowcytometeret tæller antallet af T-celler (rød og grøn farve) og T-celler (grøn farve) og opretter et histogram.

Cross-matchning for autoantistoffer mod lymfocytter:

Under en krydskamp kan autoantistoffer mod lymfocytter i modtagerens serum binde ikke specifikt til donorlymfocytterne og give et falskpositivt krydskampresultat; og derfor er donoren fejlagtigt diskvalificeret fra donerende organ til den særlige modtager. Autoantistoffer kan også maskere tilstedeværelsen af ​​specifikke anti-donor antistoffer.

Tilstedeværelsen af ​​autoantistoffer mod lymfocytter opdages ved den automatiske krydskamp, ​​hvor modtagerens egne lymfocytter og serum kombineres i en standard cytotoksicitetstest. Autoantibody cross-kampe udføres rutinemæssigt i forbindelse med alle levende donor-kryds-kampe for hvert serum, der testes.

Molekylærbiologi Metoder til HLA Typing:

De fleste molekylære typemetoder anvender polymerasekædereaktionsteknikker (PCR) til selektivt at amplificere HLA-gensegmenterne, der kræves til typing.

Sekvens-specifik Priming (SSP) Typing:

DNA fra individet ekstraheres fra celler eller væv

↓

DNA tilsættes til rør indeholdende forskellige primersæt til forskellige HLA gener. Et yderligere sæt primere indgår som en positiv kontrol af amplifikation i alle rørene.

`↓

De andre komponenter af PCR-reaktion (såsom DNA-nukleotider, DNA-polymerase, buffer) tilsættes, og den termiske cykling udføres.

↓

De amplificerede produkter elektroforeses i gel med ethidiumbromid og fotograferes under UV-lys.

jeg. Tilstedeværelse af bånd indikerer, at DNA-prøven har sekvensen svarende til den særlige HLA-type.

ii. Manglende bånd indikerer, at DNA-prøven ikke indeholder den særlige sekvens af HLA-typen.

iii. Det interne amplifikations kontrolbånd skal være til stede for fortolkning.

Sæt af primere til HLA-typing er kommercielt tilgængelige.

jeg. For HLA-A-, B- og C-typegodkendelse kræves ca. 100-200 reaktioner.

ii. For HLA-DRB typing er der brug for 20-30 reaktioner.

Sekvensspecifik Oligonukleotid Probe Hybridisering (SSOP):

SSOP-fremgangsmåden indebærer den selektive amplifikation af HLA-målet efterfulgt af hybridisering til et panel af oligonukleotidprober. Der er to SSOP-formater.

jeg. Prik eller slot blot:

Det amplificerede DNA bindes til den faste bærer (såsom nylonmembran), og hybridiseringsproben er i opløsning.

ii. Omvendt prik eller slot blot:

Sonden er bundet til den faste bærer og hybridiseret til det amplificerede DNA i opløsning.