Enzyme-Linked Immnoabsorbent Assay (ELISA) Metoder til Påvisning af Antigen

Enzyme-Linked Immnoabsorbent Assay (ELISA) Metoder til Påvisning af Antigen!

Enzymbundet immnoabsorberende metode kan anvendes til at detektere enten antigen eller antistof. ELISA-metoden har mange fordele i forhold til andre metoder (tabel 27.2).

ELISA-metoden er 10 til 1000 gange følsom end de ældre metoder som agglutination og immunoelektroforese. En række modifikationer af ELISA er tilgængelige, hvoraf nogle er beskrevet her.

Tabel 27.2: Fordele ved enzymimmunoassays

1. Forstærkningseffekt af enzymer resulterer i udvikling af mere følsomme analyser

2. Reagenser har en lang holdbarhed og er forholdsvis billige

3. En bred vifte af analysekonfigurationer kan udvikles

4. Udstyr er billigere og fås bredt

5. Ingen strålingsfarer

6. Kan også udføres i små laboratorier

ELISA til assayantistoffer:

Kendt antigen belægges på en mikroliter pladebrønde (lille plastplade behandlet for at maksimere proteinbindingen; indeholder 96 brønde med et volumen på 200 μl).

↓

Humant test serum tilsættes til brønden og inkuberes.

jeg. Hvis serumet indeholder antistoffer mod det overtrukne antigen, binder antistofferne til antigenerne.

↓

Brøndene vaskes for at fjerne ubundne serumkomponenter.

↓

Enzymkonjugeret anti-humant immunglobulin (kendt som konjugat) tilsættes til brøndene og inkuberes.

ii. Konjugatet binder til de antigenbundne antistoffer i brønden.

iii. Hvis testserumet ikke indeholder antistoffer mod antigenet, forbliver konjugatet i opløsningen.

↓

Brøndene vaskes for at fjerne ubundet konjugat.

↓

Et passende substrat tilsættes til brøndene og inkuberes.

iv. Konjugatets enzym i antigen-antistof-konjugatkomplekset virker på substratet og splittes substratet for at fremstille et farvet produkt. Udvikling af farve indikerer, at antistof specifikt for antigenet belagt på brøndene er til stede i testserumet.

v. Ikke-udvikling af farve indikerer, at testserumet ikke har antistoffer mod antigenet belagt på brøndene.

↓

En stopopløsning (normalt IN svovlsyre) tilsættes for at standse reaktionen. Derefter opbevares pladen i en ELISA-læser, og brøndens optiske densitet (OD) måles. OD'en svarer til mængden af ​​antistof i testserumet.

Ved anvendelse af kendte koncentrationer af antistoffer kan en graf konstrueres. Antistofkoncentrationerne er plottet på X-aksen, og de tilsvarende OD'er er plottet på Y-aksen, og en kurve tegnes. Ved at interpolere OD-værdien af ​​testserumet bestemmes koncentrationen af ​​antistoffer i et testserum.

ELISA til assayantigener:

Et kendt monoklonalt antistof (betegnet primært antistof) til et antigen overtrækkes på mikrotiterbrøndene.

↓

Prøven antages at indeholde antigenet tilsættes til brønden og inkuberes.

jeg. Hvis prøven indeholder det tilsvarende antigen, binder antigenet til antistoffet på brønden og danner et antigen-antistofkompleks.

↓

Brøndene vaskes for at fjerne ubundne materialer.

↓

Et kendt enzymkonjugeret mAb (kaldet som konjugat) mod antigenet tilsættes til brøndene, og pladen inkuberes.

jeg. Hvis brønden indeholder antigen-antistofkompleks, binder konjugatet til antigenet i komplekset.

ii. Hvis der ikke er noget antigen-antistofkompleks, forbliver konjugatet i opløsning.

↓

Brøndene vaskes for at fjerne det ubundne konjugat. Et passende substrat tilsættes og inkuberes.

jeg. Hvis der er konjugat i brønden, spalter konjugatets enzym substratet og producerer et farvet produkt.

iii. Manglende udvikling af farve indikerer, at der ikke er noget antigen i prøven (mod antistoffet belagt på brøndene).

↓

En stopopløsning tilsættes for at stoppe reaktionen. OD'er af de enkelte brønde læses i ELISA-læseren. Som tidligere forklaret konstrueres en graf (bestående af forskellige koncentrationer af antigener på X-aksen og de tilsvarende OD'er på Y-aksen) og kurven tegnes. Koncentrationen af ​​antigenet i testprøven bestemmes ved interpolering af dens OD.

Antibody Capture ELISA Method:

Brønde af mikrotiterpladen overtrækkes med anti-humane IgM-antistoffer.

↓

Patientens serum tilsættes og inkuberes. IgM-antistofferne i serum binder til de anti-humane IgM-antistoffer på brøndene.

Brøndene vaskes, og derefter tilsættes et kendt antigen og inkuberes.

jeg. Hvis IgM antistoffer mod antigenet er til stede i brønden, binder antigenet til IgM antistoffet og forbliver i brønden.

↓

Brøndene vaskes for at fjerne ubundet antigen

↓

Et enzymkonjugeret mAb til antigenet tilsættes og inkuberes.

jeg. Hvis antigen er til stede i brøndet (anti-IgM-IgM-antigen-komplekset), binder konjugatet til antigenet.

↓

Brøndene vaskes for at fjerne ubundet konjugat og substrat tilsættes.

jeg. Udvikling af farve indikerer, at IgM antistoffer mod antigenet er til stede i patientens serum.

ii. Ikke-udvikling af farve indikerer, at patientens serum ikke indeholder IgM-antistoffer mod antigenet.

↓

Stopopløsning tilsættes, og OD'erne af brønde måles individuelt i ELISA-læseren. Mængden af ​​IgM antistoffer mod antigenet kan bestemmes ved at tegne en graf som beskrevet tidligere.

En lignende fremgangsmåde kan vedtages for at detektere IgG-antistoffer mod et antigen.

De enzymer, der almindeligvis anvendes i ELISA-teknikkerne, er peberrodperoxidase og alkalisk phosphatase (tabel 27.3). Disse enzymer kobles kovalent til mAbs. En række substrater påvirkes af disse enzymer til fremstilling af farvede produkter. Da det sidste trin i ELISA-metoden er enzymatisk, er ELISA-metoden ekstremt følsom (dvs. meget lave koncentrationer af antigen eller antistof er påviselige).

Sensibilitet af ELISA assays forbedres ved anvendelse af yderligere reagenser (for eksempel biotin / avidinimmunoassay). For nylig har brugen af ​​peberrodsperoxidasesubstrater, der producerer kemiluminescerende produkter, yderligere forbedret følsomheden. Måling af reaktionshastigheden i stedet for reaktionsgraden ved et enkelt fast øjeblik giver mere nøjagtige kvantitative ELISA-resultater.

Tabel 27.3: Karakteristik af enzymer anvendt i enzymimmunoassays:

Biotin-Avidin Enhanced ELISA:

I stedet for at mærke mAb'et med et enzym, kan MAb mærkes med biotin (Vitamin B ₁₂ ).

↓

Derefter tilsættes enzym mærket avidin (en proteinkomponent af æggehviden).

↓

Avidin binder til biotin med meget høj følsomhed og affinitet. Derefter tilsættes substratet. Enzymet (i mAb-biotin-avidin-enzym) komplekset virker på substratet og frembringer et farvet produkt.

Biotin-avidinforøgelse anvendes også i immuno-fluorescerende assays.

Microparticle Enzyme Immunoassays:

I stedet for at overtrække mikro-titerpladebrøndene med antigener eller antistoffer overtrækkes små perler (1 mm i diameter) med antigen eller antistof, og ELISA-assays udføres. Mikropartiklerne tilbyder større overfladeareal til antigen eller antistofcoating, således at højere koncentrationer af antigen eller antistof kan belægges, hvilket hjælper med at forkorte den tid, der kræves for bindingsreaktioner.

Fluorescerende enzymimmunoassay er identisk med andre EIA'er, bortset fra at de bruger fluorescerende substrater. I den fluorescerende EIA genereres fluoroforen ved en enzymreaktion. Efter excitation af fluoroforet ved dets optimale bølgelængde udsendes lys ved en karakteristisk bølgelængde. Det udsendte fluorescerende lys måles.

Tidsløst Fluoroimmunoassay:

Denne metode kræver særlig instrumentering og specielle fluorescerende mærker for at øge analysens følsomhed. Den fluorescerende mærkning, der anvendes i dette assay, udviser en forsinket fluorescens med en tidsperiode på 100 ns eller mere mellem excitation og emission. De fleste stoffer, der er ansvarlige for baggrundsfluorescensen, har en kort henfaldstid. Derfor vil måling af det forsinkede fluorescenssignal reducere virkningerne af baggrundsfluorescens.

Dette formål opnås ved brug af et specielt tidsopløst fluorometer, der frembringer en hurtig lyspuls, der springer fluoroforen. Fluorescens måles lidt efter excitation. Således kan effekten af ​​ikke-specifik baggrund, som generelt falder på mindre end 10 ns, elimineres.

Fluoroforerne, der udviser forsinket fluorescens, er:

jeg. Pyrenederivater med en nedbrydningstid på næsten 100 ns.

ii. Sjældne jordmetalchelatmærker [som europium (Eu ³⁺ ), samarium (Sm ³⁺ ) og terbium (Tb ³⁺ )], der har en meget lang henfaldstid på ca. 50 til 100 μs.

Kemiluminescerende immunoassay:

Kemiluminescerende immunoassays (CL-EIA'er) anvender kemiluminescerende substrater, der reagerer med forskellige enzymer. Den kemiluminescerende substrat-enzymreaktion frembringer lys, der ligner bioluminescens. De kemiluminescerende EIA-systemer er en konkret forbedring i forhold til RIA'er med hensyn til følsomhed, tidseffektivitet og proceduremæssig enkelhed.

Chemiluminescensimmunoassays bruger kemiluminescensgenererende molekyler som mærker.

jeg. Luminolderivater

ii. Acridiniumestere

iii. Nitrophenyloxalatderivater

iv. Rutheniumtri-bipridyl med tripropylamin til elektrokemiluminescens

v. I princippet adskiller analysemetoderne sig ikke fra RIA'er / FIA'er.