Komplementanalyser af antigener og antistoffer

Komplementanalyser af antigener og antistoffer!

Metoder til nøjagtig bestemmelse af hver af komplementkomponenterne i alle de tre komplementaktiveringsveje og flere enzymer og regulatorer af komplementsystemet er tilgængelige.

Imidlertid er mange af analyserne kun tilgængelige i forskningslaboratorier.

Der er to typer komplementanalyser:

1. Analyser, der måler komplementproteiner som antigener.

2. Assays, der måler den funktionelle aktivitet af komplement.

Assays, der måler komplementproteiner som antigener, er generelt enkle at udføre, billige, mindre tidskrævende og kan gøres i mange laboratorier. Men disse antigeniske assays tilvejebringer ikke information om komplementkomponenternes funktionelle evner, fordi disse komplement-antigenanalyser detekterer både funktionelt aktive komplementkomponenter såvel som komplementnedbrydningsprodukterne.

jeg. Generelt er antigeniske assays ikke så følsomme som funktionelle assays.

ii. Antigeniske assays registrerer ikke lave niveauer af komplementkomponenter i visse kropsvæsker.

iii. ELISA-analyser er tilgængelige til måling af splitprodukter af komplementkomponenter eller komplekser, der dannes under komplementaktivering.

iv. Komplementaktivering via den klassiske vej kan måles ved at følge niveauerne af C4d og C4 i serumet.

v. ELISA-måling af C1r-C1s-C1INH-komplekser giver et mål for komplementaktivering via klassisk vej.

vi. Aktivering af alternativ vej kan måles ved ELISA-metode ved at vurdere niveauerne af Bb eller C3bBbP-komplekser i omløb.

vii. Aktivering af klassisk eller alternativ vej kan overvåges ved at måle niveauerne af iC3b eller den opløselige form af membranangrebskompleks sC5b6789.

viii. ELISA-kits til måling af anaphylotaxin C3a og C5a i serum eller plasma er tilgængelige.

Prøvehåndtering til komplementanalyser:

Korrekt håndtering af prøver er kritisk for komplementfunktionelle analyser. Nogle af komplementkomponenterne er stærkt labile.

jeg. For de fleste funktionelle assays foretrækkes serum, snarere end plasma, fordi calciumchelatatorer (såsom EDTA, heparin) anvendt til opnåelse af plasma, kan være anti-komplementære.

ii. Ved funktionelle analyser skal blodet koagulere ved stuetemperatur i 30-60 minutter og derefter på is i mindst en time.

iii. For Clq bindingsassays bør blodet koagulere i 2 timer ved stuetemperatur. Klumpen rimmes og centrifugeres ved 0 ° C til 4 ° C i fem minutter. Hvis cryopræcipiterende antistoffer mistænkes, skal dannelse af blodpropper og centrifugering af blodet udføres ved 37 ° C, fordi komplementfiksering kan forekomme, hvis prøven afkøles.

iv. Serum- eller plasmaprøver skal alikvoteres i flere små mængder og opbevares straks ved 40 til -80 ° C.

v. Når sera overføres, skal de forsegles godt og anbringes i beholdere med store mængder tøris.

Komplement Funktionelle Assays:

Bufferne anvendt i komplementfunktionelle assays er kritiske, fordi ændringer i molaritet og metalionkoncentrationer kan påvirke komplementstiterværdierne. CH _50- analyse for klassisk komplementvej: Den enkleste funktionelle analyse af den klassiske vej måler total hæmolytisk komplement.

Fraværet af nogen af ​​komplementkomponenterne resulterer i en total hæmolytisk komplementstiter (CH50) på nul. Får erythrocytter anvendes generelt som målceller til måling af CH50 eller den funktionelle aktivitet af isolerede komplementkomponenter. Får-RBC'er er mere følsomme for antistof og komplement-medieret lysis end RBC'erne af andre arter.

AH ₅₀ assay for alternativ komplementbane:

Kanin erythrocytter anvendes til at måle AH ₅₀ . Kanin-RBC'er er følsomme for antistof-uafhængig lysis medieret af humant serum.

jeg. CH50 og AH50 assays er fremragende screeningsassays for at udelukke genetisk mangel på komplementkomponenter.

ii. Normal CH ₅₀ aktivitet med reducerede AH _50- værdier skyldes defekter i alternativ komplementvej.

iii. Mangler i terminalkomplementkomponenterne resulterer i tab af både CH ₅₀ og AH ₅₀ aktiviteter.

iv. Homozygot mangel på en komplementkomponent ophæver fuldstændigt det hæmolytiske assay.

Graden af ​​hæmolyse påvirkes af mange faktorer, såsom erytrocytkoncentrationen, ømhedens (alder) af erythrocytterne, mængden af ​​antistof anvendt til sensibilisering, antistoffets art (IgG eller IgM), buffersystemets ionstyrke, PH, reaktionstid, temperatur og calcium ²⁺ eller magnesium ²⁺ koncentrationer. Værdien for CH50-enheder i humant serum beregnes på flere måder, såsom Von krough-ligning.

Måling af funktionel mangel på individuelle komplementkomponenter:

Når en patients historie og symptomer antyder en mulig komplementkomponentmangel, kan hæmolytiske titreringer af den enkelte komponent være påkrævet. Til fremstilling af lyser af erythrocytter er tilstedeværelse og aktivering af hele komplementkomponenterne (C1-C9) nødvendige. Hvis en komponent er fraværende, forekommer hæmolyse ikke. Rene præparater af hver enkelt enkelt komplementkomponent er nødvendige for at detektere fraværet af en bestemt komplementkomponent i en patients serum eller plasma.

For at måle individuelle komplementkomponenter kræves der delvist rensede komponenter. Måling af C4 er imidlertid en undtagelse på grund af tilgængeligheden af ​​C4-deficient (C4D) marsvin serum. Sera fra C2-mangelfulde mennesker og marsvin og C6-deficiente kaniner fås i få laboratorier.

Funktionelle komplementanalyser af individuel komponent er følsomme og tilvejebringer nøjagtige informationer om aktiviteten af ​​en komplementkomponent. Men de fleste af disse analyser er begrænset til forskningslaboratorier.

Måling af individuel komplement-komponent ved antigenanalyse:

Enkelt radial immundiffusion er den mest almindelige metode til kvantificering af komplementkomponenter, såsom C3, C4 og faktor B. Det skal huskes, at alle komplementfunktionelle assays kan hæmmes ved anti-komplementær virkning af serum (som kan skyldes antigen- antistofkomplekser, heparin, chelateringsmidler og aggregerede immunglobuliner).

Complement Fixation Test:

Når der er antigen-antistof-interaktion, aktiveres og forbruges komplementkomponenterne. Derfor indikerer in vitro testforbrug af komplement tilstedeværelsen af ​​antigen-antistof-interaktion. Dette princip anvendes til at detektere og måle antigen eller antistoffer i komplementfikseringstesten.

Prøven udføres i to faser. I det første trin forekommer antigen-antistof-interaktion, og komplementet forbruges. I anden fase bruges et indikatorsystem til at detektere, om komplement forbruges eller ikke i første fase reaktion.

jeg. Hvis komplementet forbruges i det første trin, betyder det, at antigen-antistofreaktion har fundet sted i første fase.

ii. Hvis komplement ikke forbruges, betyder det, at der ikke var nogen antigen-antistof-interaktion i første fase.

Påvisning af antistof ved komplement-fixeringstest:

Første fase:

Faste koncentrationer af kendt antigen og komplement (sædvanligvis frisk marsvinserum anvendes som komplementkilde) tages. Serum indeholdende (ukendte antistoffer) tilsættes og inkuberes.

A. Kendt antigen + komplement + serum (tilsvarende antistoffer til stede). Komplementet forbruges under inkubation.

B. Kendt antigen + komplement -1-serum (tilsvarende antistoffer fraværende). Komplementet forbruges ikke, fordi serumet ikke indeholder antistoffer, der er specifikke for det kendte antigen.

Andet trin:

Får erythrocytter overtrukket med kanin anti-får erythrocyt antistoffer sættes til rørene. Ved tilstedeværelse af komplement vil får erythrocytter ved lyseret (hæmolyse). I fravær af komplement vil erytrocytterne ikke lyse (ingen hæmolyse).

A. Da komplementet anvendes under den første trinreaktion, lyseres de antistofbelagte får erythrocytter ikke. Derfor antyder fravær af hæmolyse, at serumet indeholder specifikke antistoffer mod antigenet anvendt i testen.

B. Da komplementet ikke anvendes i det første trin, hæmmes de antistofbelagte får erythrocytter af komplementet i anden fase. Derfor antyder tilstedeværelsen af ​​hæmolyse, at serumet ikke indeholder specifikke antistoffer mod det anvendte antigen.

Kompletteringsforsøg testes i vid udstrækning i kliniske laboratorier og forskning. Virus, serumantistoffer mod virale infektioner, antistoffer mod Treponema pallidum, der forårsager syfilis, anti-svampeantistoffer (Coccidioidomycosis immitis, Histoplasma capsulatum), anti-Mycoplasma pneumoniae antistoffer og anti-ricketsielle antistoffer detekteres ved komplementfikseringstest.