DNA-replikation: Mekanismer af DNA-replikation

Nogle af de vigtigste metoder til DNA-replikation er som følger!

DNA-replikation i eukaryoter er semikonservativ, semi-diskontinuerlig og tovejs sammenlignet med semiconservativ, tovejs og kontinuerlig i prokaryoter.

Billedrettighed: dbriers.com/tutorials/wp-content/uploads/2012/12/DNA_replication_split.png

DNA-replikation sker under S-fase af cellecyklus. Det er en multistep kompleks proces, der kræver over et dusin enzymer og proteinfaktorer. Det begynder på et bestemt sted kaldet replikationssted eller ori. Bakterielt og viralt DNA har en enkelt oprindelse af replikation. Det fungerer som en enkelt replikerende enhed eller replikon.

I eukaryotisk DNA er der en række oprindelsesreplikationer. Den har flere replikerende segmenter eller replikoner, dvs. multirepliconic. I fravær af ori vil replikation ikke forekomme. Kravet om en vektor til rekombinant DNA-teknologi er at opnå oprindelse af replikation.

Replikation af DNA er energisk meget dyrt. Det vigtigste enzym af DNA-replikation er DNA-afhængig DNA-polymerase. DNA-replikation er ret hurtig. Replikationen af ​​DNA fra E. coli med 4, 6 x ¹⁰⁶ bp kræver 19 minutter.

Ved en gennemsnitlig polymerisering af baser er 2000 bp pr. Sekund i hver retning. Replikation kræver rigelig energi, der kommer fra nedbrydning af triphosphater af deoxyribonukleotider.

Replikationen foregår som følger:

1. Aktivering af deoxyribonukleotider:

Deoxyribonukleotider eller deoxyribonucleosidmonophosphater forekommer frit inde i nukleoplasmaet. De er af fire typer deAMP (deoxyadenosinmonophosphat), deGMP (deoxyguanosinmonophosphat), deCMP (deoxycytidinmonophosphat) og deTMP (deoxythymidinmonophosphat). De er først phosphorylerede og ændret til aktive former, der har tre fosfatrester i stedet for en. Enzymer phosphorylase er påkrævet sammen med energi.

De phosphorylerede nukleotider er deATP (deoxyadenosintrifosfat), deGTP (deoxyguanosintrifosfat), deCTP (deoxycytidintrifosfat) og deTTP (deoxythymidintrifosfat). Disse triphosphater af baser tjener dobbelt formål. De virker som substrat såvel som tilvejebringer energi til polymerisering af nukleotider.

2. Eksponering af DNA-strenger:

Enzymhelicase (unwindase) virker over Ori-stedet og udpakker de to tråde af DNA ved at ødelægge hydrogenbindinger. De adskilte tråde stabiliseres ved hjælp af enkeltstrengede bindingsproteiner (SS BP'er) eller helixstabiliserende proteiner. Unwinding skaber spændinger i den ubundne del ved at danne flere supercoils. Spændinger frigives af enzymer topoisomeraser.

De forårsager knægtning og genvinding af DNA-strengen. Sammen med topoisomerase har bakterier et andet enzym kaldet DNA gyrase, som kan introducere negative supercoils (ældre arbejdstagere mente at gyrase fungerede både for helicase og topoisomerase).

Ved hjælp af forskellige enzymer bliver begge strengene af DNA åbne for replikation. Hele DNA'et åbner dog ikke i en strækning på grund af et meget højt energibehov. Separationspunktet går langsomt i retning af begge retninger. I hver retning giver det udseende af Y-formet struktur kaldet replikationsgaffel (Fig. 6.13 og 6.14).

3. RNA Primer:

Det er vigtigt for indledningen af ​​nye DNA-kæder. RNA primer er en lille RNA-streng, som syntetiseres ved 5'-enden af ​​den nye DNA-streng ved hjælp af DNA-specifikt RNA-polymeraseenzym, der hedder primase. RNA primer er dannet på den frie ende af en streng og gaffel ende af den anden streng. Dannelse af RNA-primer udgør initieringsfasen af ​​DNA-syntese, fordi dna-polymeraser uden tilstedeværelse af RNA-primer ikke kan tilføje nucleotider.

Et mere komplekst enzym kaldet primo nogle er påkrævet i fag ф x 174 og nogle andre prokaryote systemer. I eukaryoter udføres primasfunktionen af ​​enzym-DNA-polymerase a. Det bygger op ~ 10 base RNA og 20-30 baser af DNA (Lewin, 2004). Efter start af nukleotidkæde fjernes RNA-primer, og mellemrummet er fyldt af DNA-polymerase I i prokaryoter og DNA-polymerase P i eukaryoter.

4. DNA-polymeraser:

Prokaryoter har tre hovedtyper af DNA-syntetiserende enzymer kaldet DNA-polymeraser III, II og I. Alle tilføjer nukleotider i 5'-> 3'-retningen på 3'-> 5'-strækningen af ​​moderstrengen. De har også 3 '-> 5' exo-nuklease aktivitet. Mens DNA-polymerase III hovedsageligt er involveret i DNA-replikation (tilsætning og polymerisering af nye baser), er polymerase I stort reparationsenzym. Polymerase II er mindre reparationsenzym.

DNA-polymerase I har også 5 -> 3 exonukleaseaktivitet. I eukaryoter findes fem typer DNA-polymeraser-α, β, γ, δ og ε, men de største tre er α, δ og e. Polymerase 8 er involveret i replikation af ledende streng. Polymerase kan medvirke til syntese af aftagende streng alongwith andre roller. Polymerase a er størst og primære enzym til replikation af DNA. Alle DNA-polymeraser har en konfiguration af gribende hånd med tommelfinger på den ene side, fingre på den anden og palmen som et konkavt katalytisk sted til at kombinere skabelon og basepar.

5. Base Pairing:

De to adskilte DNA strenge i replikationsgaffelfunktionen som skabeloner. Deoxyribonukleosidtrifosfater kommer til at ligge overfor nitrogenbaserne af udsatte DNA-skabeloner - deTTP modsat A, deCTP modsat G, deATP modsat T og deGTP modsatte C.

Nukleofilt angreb adskiller et pyrophosphat (PPi) fra triphosphatet. Phosphodiesterbindinger er etableret. Hydrolyse af pyrophosphat ved enzym pyrophosphatase frigiver energi. Deoxyribouncleosidtriphosphat → Deoxyribouncleosidmonophosphat + PPi

Energien anvendes til at etablere hydrogenbindinger mellem de frie nukleotider og nitrogenbaser af skabeloner.

6. Kæden dannelse:

Det kræver DNA-polymerase III (Kornberg, 1956) i prokaryoter og polymerase 8 / e i eukaryoter. DNA-polymerase III er et komplekst enzym med syv underenheder (a, β, い, ƴ, €, θ, τ). I nærværelse af Mg ²⁺, ATP (GTP), TPP og DNA-polymerase III, fastslår de tilstødende nukleotider, som er knyttet til nitrogenbaser af hver template-DNA-streng, phosphodiesterbindinger og får forbindelse til dannelse af replikeret DNA-streng.

Efterhånden som replikationen forløber, afvikles og adskilles nye områder af DNA-duplex i overordnet form, således at replikationen forløber hurtigt fra oprindelsesstedet mod den anden ende. RNA primer fjernes, og mellemrummet fyldes med komplementære nukleotider ved hjælp af DNA-polymerase I. På grund af sekventiel åbning af DNA-dobbeltkæde og dens replikation til dannelse af to kæder, kaldes DNA-replikation også lynlåsduplikation.

Imidlertid kan DNA-polymerase kun polymerisere nukleotider i 5 '→ 3' retning på 3'-> 5'-streng, fordi den tilføjer dem ved 3'-enden. Da de to tråde af DNA løber i antiparallelle retninger, tilvejebringer de to skabeloner forskellige ender til replikation. Replikation over de to skabeloner fortsætter således i modsatte retninger. En streng med polaritet У -> 5 'danner sin komplementære streng kontinuerligt, fordi 3'end af sidstnævnte er altid åben for forlængelse.

Det hedder ledende streng. Replication er diskontinuerlig på den anden skabelon med polaritet 5 '→ 3, fordi kun et kort segment af DNA-streng kan bygges i 5'→ 3 retning på grund af eksponering af en lille skabelon på én gang. Korte segmenter af replikeret DNA kaldes Okazaki-fragmenter (= Okasaki-segmenter; Reiji Okazaki, 1968). Hver af dem har 1000-2000 bp i prokaryoter og 100-200 bp i eukaryoter.

En RNA-primer er også påkrævet hver gang et nyt Okazaki-fragment skal bygges. Efter udskiftning af RNA-primer med deoxyribonukleotider og deres polymerisering, forbindes Okazaki-fragmenter ved hjælp af enzym, DNA-ligase (Khorana, 1967). DNA-streng opbygget af Okazaki-fragmenter kaldes lagende streng.

Da en streng vokser kontinuerligt, mens den anden streng dannes diskontinuerligt, er DNA-replikation halvdiskontinuerlig. Da replikation fortsætter tovejs fra oprindelsen af ​​replikation eller ori, vil en overordnet streng danne en ledende streng på den ene side og den laggende streng på den anden side. Det omvendte sker på forældrene på den anden side. Dette hjælper med at fuldføre replikation samtidigt i hele replikonet.

7. Proof-læsning og DNA Reparation:

En forkert base indføres undertiden under replikation. Frekvensen er en ud af ti tusind. DNA-polymerase III er i stand til at fornemme det samme. Det går tilbage, fjerner den forkerte base, tillader tilføjelse af korrekt base og derefter fortsætter fremad. Selv DNA-polymerase III kan imidlertid ikke skelne uracil fra thymin, så det ofte inkorporeres i stedet for thymin. En sådan mismatching korrigeres ved hjælp af et antal enzymer.

Der er en separat reparationsmekanisme for enhver skade, der er forårsaget af DNA på grund af mutation, UV-eksponering eller mismatching, der undgår korrekturlæsningsmekanisme. En nick eller pause skyldes en endonuklease i nærheden af ​​reparationsområdet. DNA-polymerase I (Komberg, 1969) fjerner de mismatchede eller forkerte nucleotider, hvis de er til stede, og syntetiserer en korrekt erstatning ved anvendelse af den intakte streng som skabelon. Det nydannede segment forsegles af DNA-ligase.