Kryopreservering af gameter i fisk
I denne artikel vil vi diskutere om cryopreservering af gameter i fisk.
Cryopreservation er en lagringsteknik med næsten ingen tidsbegrænsninger. Bevarelse af fiske gameter er blevet forsøgt med denne teknik. Cryopreservation af sæd er en veletableret procedure i husdyrhold.
Nu krydreserverede sædceller anvendes succesfuldt ved inseminering af kvæg, hest, svin, får og fjerkræavl. Det er interessant at bemærke, at der er lagt store anstrengelser for at overføre denne teknologi til bevarelse af sæd, æg og embryoner af fisk.
Denne teknik hjælper fiskeopdrættere på følgende måder:
(1) Problemet med ikke-sammenfaldende modning af mænd og kvinder kan overvinde, hvis sæd eller æg holdes i opbevaring.
(2) Programmet for selektiv opdræt kan gennemføres, som vil forbedre den oprindelige bestand og vil hjælpe den tredje verden til at opdrætte deres oprindelige arter og til at producere særlige stammer af overlegen stilk.
(3) Kryopreserveringen af gameter vil spille en vigtig rolle i bevarelsen af oprindelig germplasma, da mange indfødte indiske fisk ikke kan konkurrere med eksotiske fisk. Med denne teknik bliver gameterne fra truede arter banket som en hække mod svindende genetisk variation forårsaget af miljøforstyrrelser.
(4) Det kan bidrage til produktion af monokøn kultur.
(5) Hvis gameter kan opretholdes med succes, kan vi udvikle fisk hele året efter vores krav og kan hjælpe med at etablere genbank for at bevare befolkningens genetiske originalitet og holde dem tilgængelige for genindførelse, når de generelle betingelser for overlevelse er forbedret.
Spermene, æggene og embryoerne kan kryopreserveres, men bevarelsen af æg og embryoner er vanskelig på grund af utilgængeligheden af kryobeskyttelsesmiddel, der absorberes tilstrækkeligt i disse celler på grund af deres store størrelse i sammenligning med spermatozoer.
Cryopreservation af spermatozoer i fisk er vellykket hos mennesket; arter Disse arter er Oncorhynchus, Salmo, Salvilinus fontinalis, Hucho hucho, Thymallus thymallus, Esox lucius og Cyprinus carpio, Serothodon mossambicus; Labeo Rohita, Catla Catla og Cirrhinus Mrigala.
Følgende trin skal følges ved bevarelse af spermatozoer:
(1) Indsamling af milt (sæd).
(2) Fremstilling af forlængelsesopløsning.
(3) Udvælgelse af kryobeskyttelsesmiddel.
(4) Frysning.
(5) Succes ved befrugtning.
Indsamling af Milt:
Det første skridt er at samle sædceller. Normalt opsamles sædene fra sunde fisk ved strippemetode. Kateteret kan anvendes, hvilket er bedre alternativ til stripping. De mandlige opdrættere med de bedste karakteristiske træk blev udvalgt og vasket med Ringers-opløsning og genital papillegruppe blev tørret.
Broderen kan blive bedøvet eller ikke bedøvet. Den anvendte anæstesi er 0, 3 ml / l phenoxyethanol. Ifølge Kumar (1989) giver en injektion af suston 250 (organon) før stripping bedre resultat i indiske carps. Flertallet af arbejdere på dette område anbefalede ikke-bedøvede fisk til stripping for at opnå mild.
Maven samles i sprøjter eller hæmolyserør og senere bevaret i glasampuller (forseglet eller uforseglet), plaststråler og ofte i plastikposer. Farve, volumen, densitet, pH og bevægelighed af sæd skal bemærkes.
Prøven bør være fri for urin og fæces. Et udsnit af prøven skal undersøges under mikroskop for at opdage abnormiteter i sædceller. Hvis prøven er OK, sættes den til videre forarbejdning, ellers kan frisk prøve fra nye brødere tages.
I løbet af perioden for opsamling og konservering af spermatozoer kan sprøjten / ampullerne / halmen holdes i dam vand for at opretholde konstant temperatur. Legendariske og Billard (1980) opsamlede sædceller i hæmolyserør i smeltende is og opbevares derefter på en nedkølet overflade ved 4 ° C.
Udarbejdelsen og udvælgelsen af extender, en opløsning, hvor der er opsamlet milt, er mest kritisk for cryopreservering. Forstærkeren forhindrer udtømning af spermieenergi og opretholder sæd i skiftende tilstand, men levende.
Der er to grundlæggende forlængere. De hedder Mounibs medium (M) og Menezo medium (Me). I disse to medier tilsættes bovint serunalbumin (BSA) og tellurit æggeblomme. For indiske fisk blev flere udvidere forsøgt ved at ændre i deres følgende bestanddele.
De fælles bestanddele er natriumchlorid, KCI, CaCl2, NaHC03, Na2HP04 og MgS04. Ud over disse er også næringsstoffer og glycin tilsat for at forbedre cryopreserveringen. Antibiotika såsom gentomycin eller streptomycin tilsættes også til forlængelsesopløsningen, hvis det er nødvendigt.
kryoprotektant:
Cryoprotectantens hovedfunktion er at trænge ind i cellen og kan hjælpe spermatozoer til at tolerere frysetemperatur. Den vigtigste og mest anvendte er DSMO (Dimethyl sulfoxid) og glycerol. Harvey (1983) anvendte methanol, DSMO og glycerol i kombination med mælkepulver eller æggeblomme.
Kryosikrings- og forlængelsesopløsning i et fast forhold, generelt er en del af krybeskyttelsesmiddel og ni dele af forlængelsesopløsning kendt som fortyndingsmiddel. I dette fortyndingsmiddel opsamles sædene til yderligere behandling til frysning.
Fortyndingsmidlet (cryoprotectant + extender + spermier) er taget i polyvinylstråler, og begge ender af strøer er forseglet, og nu er de klar til frysning eller afkøling. Mælten kan afkøles, temperaturen holdes mellem 0-5 o C. Ved frysning anvendes CO 2 og flydende nitrogen. Kølet opbevaring af teleostmælk (0-50 o C) er blevet undersøgt meget i laksefisk.
Ved fryseproceduren bør mange problemer såsom kold shock, dannelse af intracellulær is og osmotisk shock kontrolleres. Kryopreservering betyder generelt opbevaring af celler eller væv ved -196 o C, temperaturen af flydende nitrogen (figur 22.1).
Cell skade bør kontrolleres. Tre typer celleskade forekommer generelt. Den første er koldt stød, hvilket skyldes afkøling over frysende temperaturer. Dette er vigtigere for æg, ikke særlig vigtigt for sædceller.
Dette sker op til 0 ° C. Når temperaturen går fra 0 ° C til -80 ° C finder sted det osmotiske chok og dannelsen af intracellulær is i æg og sæd. For vellykket cryopreservation kontrolleres disse ting.
Kort sagt overføres strøerne indeholdende fortyndingsmiddel til cannisters. Cannisterne, der holder strøer efter at have tilladt varierende ækvilibreringsperiode, dyppes først i flydende nitrogen-dampe og derefter til flydende nitrogen ved temperaturen -196 ° C. Legendra og Billard (1980) lagrede sædene af regnbueørreder i tøris (fast CO 2 -79 ° C) eller i flydende nitrogen i op til 6 måneder.
I en række ferskvandsarter er frysning blevet udført ved pelletering, suspenderer sædceller i tøris. Overgangen fra 0 ° C til -70 ° C varer cirka 2 minutter, hvilket resulterer i en hastighed på 35 o C / min. Da satsen falder over - 60 ° C. De bedste resultater opnås i flydende nitrogen.
optøning:
Optøningen er omvendt ved frysning. Opdining sker i vandbad ved temperaturer fra 10 ° C til 60 ° C. Succesen for hele proceduren afhænger af spermatozoas bevægelighed og evne til at befrugte æg.
Stoss og Holtz (1982) har forøget motiliteten af pink salmon spermatozoa fra 30 sek til 10 minutter ved at aktivere med en 120 nm NaHCO 3- opløsning, hvortil 1 BMX (3-isobutyl-1-methylxanthium) var blevet tilsat. Kumar (1989) udtalte, at længden af opbevaringsperioden er ca. 20 dage i L. rohita og H. molitrix under kryogen tilstand.
Æg af Salmo gairdeneri, Onchorhynchus kisutch og O.keta blev fikseret ved at fjerne gennem processen med stripping og forseglet i plastikposer sammen med coelomvæske og holdt under oxygen ved 1 ° C. Ægene får lov til at sprede sig for at danne et lag et eller to æg dybt.
Ægene blandes derefter med forlængelsesopløsning og kryoprotektive middel på næsten samme måde som tidligere beskrevet for sædceller. Ifølge Harvey og Kelley (1984) har opdrættet (kølet) opbevaring af æg været moderat succesfuld i laksefisk med opbevaringstider i løbet af få uger opnået ved køling af iltede æg i coelomvæske.
