Top 3 sekventielle trin af polymerasekædereaktion (PCR)

De følgende punkter fremhæver de tre øverste trin i polymerasekædereaktion (PCR). De sekventielle trin er: Denaturering 2. Annealing 3. Forlængelse af DNA.

Sekventielt trin # 1. Denaturering:

Det første skridt er at denaturere DNA'et (både Primer DNA og Native DNA). Separation af to tråde af DNA er kendt som denaturering, mens det medbringes to stands sammen kaldes som genanvendelse eller hybridisering (figur 48.1). Opdagelsen af ​​denaturering og genanvendelse af DNA blev gjort kunstigt af Marmor og Lane (1960).

Ifølge dem kunne det dobbeltstrengede DNA separeres i to separate enkeltstrenger (denaturering) ved opvarmning ved en høj temperatur (90-95 ° C) og hybridisering eller sammenføjning af to DNA-streng (dobbeltstrenget DNA), hvilket er muligt ved faldende temperaturen (50-56 ° C).

Dette er hovedprincippet, som PCR'en fungerer på. Det andet princip er forlængelse af primeren ved hjælp af DNA-polymeraseenzym.

Det native DNA-, primer- og DNA-polymeraseenzym (Tag-polymerase) tilsættes i et PCR-rør, og temperaturen hæves og sænkes i PCR-maskinen for at denaturere og hybridisere.

Sekventielt trin # 2. Annealing:

Efter denaturering af DNA'et er næste trin at tillade syntetiseringen af ​​primer til anneal til de modsatte DNA-tråde af den ønskede målsekvens. Annealing (hybridisering) kan forekomme, hvis temperaturen fra 95 ° C sænkes til 50/56 ° C. Temperaturen sættes så ned i maskinen.

Så snart temperaturen sænkes, vil de native DNA-tråde ikke kun binde hinanden, men også binde primrene. Denne specifikke hybridisering eller "rekombination" af komplementære nucleotider tilvejebringer både begrundelse og det praktiske grundlag for meget af rekombinant DNA (figur 48.2).

Sekventielt trin # 3. Forlængelse af DNA (Taq Polymerase Enzy er nødvendigt):

Efter at primerne har annealedet, bør de forlænges ved anvendelse af oligonukleotidprimeren som startpunktet. beskrevet, at enzym-DNA-polymerase er nødvendigt til syntese af DNA. Derfor kræver vi for en forlængelse af primer en termostabil DNA-polymerase, således at enzymet ikke ødelægges ved høj temperatur.

Den termostabile polymerase (Taq polymerase) isoleres fra Thermus aquaticus. Taq-polymerasen har en enorm fordel ved udførelse af PCR-reaktionen. Den har en optimal aktivitetstemperatur på omkring 70 ° C, og frisk enzym må ikke tilsættes til hvert reagensglas efter opvarmning og afkøling.

Termostabil DNA-polymerase fremstilles nu af forskellige firmaer med forskellige kilder (undtagen Thermus aquaticus) under forskellige handelsnavne (TM). Til forlængelsen af ​​primer sættes den termostabile DNA-polymerase i røret, og temperaturen hæves derefter til 65-70 ° C.

Efterfølgende cykler af strengseparation (denaturering), primerhybridisering (glødning) og strengsyntese (forlængelse) sikrer eksponentiel amplifikation af målsekvenserne ved anvendelse af den amplificerede sekvens, hvis den foregående cyklus som en ny template, er der tre cykler (figur 48.2 ).

Primer Making:

Primerne er korte sekvenser (ofte RNA) anvendes til fremstilling af to nucleotider, der henvises til primer, med en for hver ende af DNA-fragmentet og tilvejebringer en fri 3-OH-ende, hvorved en DNA-polymerase begynder syntese af en deoxyribonukleotidkæde.

En sekvens er lavet i retningsretningen, mens den anden er lavet i antisensretningen. (Figur 48.2). Primeren bruges til at prime syntesen af ​​gratis DNA-tråde og er designet således, at DNA'et mellem primerne er det interessante fragment, der skal amplificeres.

Hvis messenger-RNA'et (mRNA) amplificeres, skal det omdannes til gratis DNA (cDNA) ved hjælp af en RNA-afhængig DNA-polymerase, revers transkriptase. CDNA-komplekset ændres derefter til dobbeltstrenget DNA, der bliver skabelon til en efterfølgende PCR-reaktion.

Dette kaldes ofte omvendt transkriptase-polymerasekædereaktion (RT PCR). Primerne kan genereres kunstigt eller kan købes hos firmaerne.

Efter at reaktionen er afsluttet, kan de amplificerede produkter (DNA) visualiseres ved gelelektroforese. Den vigtige fysiske egenskab ved DNA-molekyle er, at hvert enkelt nukleotid besidder en netto negativ ladning resulterende fra phosphatgruppen.

Således er fragmenter af forskellig størrelse, der er udsat for et elektrisk felt, tilbøjelige til at migrere mod den positive elektrode i forskellig hastighed afhængigt af størrelsen, med små fragmenter, som migrerer hurtigere end den større. Denne proces med separationsbaseret elektrisk ladning kaldes elektroforese.

DNA-prøverne, efter at de blev fordøjet til fragmenter af forskellige størrelser med et restriktionsenzym (endonuclease), tilsættes til bærermedium, såsom agrosegel eller acrylamid. Gelens porer afhænger af sin procentdel og kan sammenlignes med en (molekylær) sigte. Således afhænger migrationshastigheden af ​​DNA-fragmenterne gennem gel af både DNA-fragmentstørrelse og påført spænding.

Fremgangsmåden til at adskille og fradrage specifikt DNA-fragment er Southern blotting. Betydningen af ​​denne teknik er, at enkeltstrengsfragmentet kan overføres ved kapillarvirkning til et fast bærermedium (nylon eller cellulosemembran) og permanent fastgjort ved opvarmning (figur 48.3).

Efter elektroforese kan DNA-mønsteret visualiseres under UV-lampe efter behandling med ethidiumbromidfarvning; ethidiumbromidet er et fluorescerende farvestof. Agrose gelelektroforese skelner fra fragmenter fra 100 basepar til 60000 basepar (60 kb), hvorimod polyacrylamidgeler effektivt adskiller fragmenter end 1000 basepar (1 kb).

Pulse-gelelektroforese (PFGE) har gjort det muligt at adskille DNA-fragmenter selv op til 2 kb. Ved denne procedure ændres det elektriske felt i forskellige retninger, hvilket tvinger molekylerne af DNA til at omorienteres mellem hver puls eller elektrisk strøm. Dette er den bedste teknik til at identificere et kendt gen.

Endonucleaserne kan genkende 3, 4, 5, 6 eller 8 basepar og er tilgængelige på markedet.

PCR buffere / salte.

For Taq DNA-polymerase fremstilles bufferen som nedenfor:

50 mM KCI

10 mM Tris-HCI ved stuetemperatur

Dimethylsulfoxid (DMSO) og glycol anvendes som co-opløsningsmiddel i PCR-buffere, når målet har meget høj denatureringstemperatur.

Deoxynukleotidtriphosphat (dNTP'er) er ionkofaktorer.

Nu leverer bioteknologiske virksomheder klare løsninger.

Grundprincippet beskrives som følger:

Der er fire dNTP'er nemlig dATP (adenintrifosfat), dCTP (cytosin), dGTP (gunin), dUTP (uracil), der anvendes i henhold til basisparreglerne for at udvide primeren og i sidste ende at kopiere målsekvensen.

DNTP binder med Mg ²⁺ . Mængden af ​​dNTP'er, der er til stede i en reaktion, bestemmer mængden af ​​fri Mg2 ^{+, der er} tilgængelig for optimal enzymaktivitet. Stock dNTP-opløsninger bør neutraliseres med Tris base til pH 7, 0, og deres koncentration bør bestemmes spektrofotometrisk.

Substrate og substratanaloger:

Taq polymerase fungerer (dNTP) meget effektivt. Imidlertid er der nogle modificerede substrater tilgængelige i stedet for Tag DNA-polymerasubstrat. De er dogoxigenin- dNTP, biotin-11-dUTP, C7deaza-dGTP og fluorescensmærkede dNTPS.

Følgende typer af PCR er generelt:

(1) indlejret PCR;

(2) RT-PCR;

(3) anker-PCR;

(4) asymmetrisk PCR;

(5) Inverse PCR;

(6) DOP-PCR.