Nylige fremskridt i diagnostik af malaria

Nylige fremskridt i diagnostik af malaria - HL Gupta, VK Talwar, A Rohtagi!

Introduktion:

I Indien er malaria et stort sundhedsproblem; der har været hyppige udbrud i Rajasthan og Nordøstlige Stater. I Rajasthan forekom P. falciparum er stigende. I Delhi P. vivax er den mest almindelige art, men P. falciparum er også stødt på. Malaria, et verdensomspændende problem, dræber hvert år mellem 1, 5 og 2, 7 millioner mennesker. Med andre ord dræber den en person (ofte et barn <5 år) hvert 12. sekund. Derudover er 300-500 millioner mennesker smittet med sygdommen hvert år.

Til bekæmpelse af sygdom er hurtig og præcis diagnose vigtigst. Malaria diagnose er ofte kun lavet på baggrund af kliniske symptomer, selvom dens nøjagtighed er i bedste fald 50 procent. Nyere avancerede diagnostiske teknikker er nu tilgængelige. Nyligt indførte undersøgelser baseret på immunoassay er hurtige (<10 min / test) og mindst lige så følsomme som traditionelle mikroskopier.

Lysmikroskopi: Tykt og tyndt blodudsmid:

Den traditionelt accepterede laboratorieprocedure til diagnose af malaria har været mikroskopisk undersøgelse af Giemsa-eller Field-stained blood smears. Ideelt set skal blod opnås ved en fingerprik; Imidlertid er blod opnået ved venipunktur og antikoaguleret (EDTA eller heparin) acceptabelt, hvis det straks undersøges. Både tykke og tynde udtværinger skal laves. Tykt smear koncentrerer røde blodlegemer 20-30 gange på en lille overflade, øger teknikkens følsomhed og er meget bedre end tynde smuds. Tyndt smear er dog mere specifikt.

Det er den accepterede guldstandard til diagnose, men er arbejdskrævende, og fortolkning af resultater kræver betydelig ekspertise, især med lav parasitæmi. Derudover kan P falciparum parasitter, der ofte sekvestreres væk fra perifert blod, let gå glip af.

Kvantificering af parasitter ved undersøgelse af blodudslip:

Der er mange metoder til at kvantificere malarial parasitter i tykke udstrygninger. Parasitniveauer kan også kvantificeres ved undersøgelse af et tyndt blodsprøjt. En stor ulempe ved tykke udtværinger er, at det ofte kræver en vis grad af ekspertise, som måske ikke er tilgængelig.

Teoretisk set skal undersøgeren tælle tykkelsesfelter indeholdende 20 eller flere leukocytter / hpf. Faktisk er marker med 20 eller flere leukocytter for tyk at tælle, mens marker, der er lettest at læse, er dem, der kun indeholder fem eller seks leukocytter / hpf.

Før farvning skal eksaminator være i stand til at læse udskriften gennem et velforberedt, tykt blodsprøjt. Undersøgelse af tynde smuds er kun en tiendedel så følsom som undersøgelse af tykke smør. Selv om undersøgelse af blodudslæt er acceptabelt som den universelle, "guldstandard", er der således ingen enkelt standardmetode, der anvendes af alle efterforskere, til kvantificering af parasitter ved at tælle parasitter i tykke udstrygninger.

Derudover begrænser mangel på mikroskoper under brug af uddannet personale brugen af ​​blodprøveundersøgelse i mange endemiske områder. I erkendelse af disse begrænsninger er alternative metoder til diagnose af malaria blevet udviklet.

Fluorescerende mikroskopi:

Tre fluorescerende teknikker holder løfte om diagnose af malaria.

Disse er:

(i) Den kvantitative buffy coat (OBC) metode, der er tilgængelig som et kommercielt kit

ii) Kawamoto Acridin Orange (AO) -processen og

(iii) Benzothiocarboxypurin (BCP) procedure.

Disse tre teknikker er hurtige og nemme at udføre; når der er mere end 100 parasitter / μL, demonstrerer de følsomhed og specificitet svarende til dem, der opnås ved tykt smearprøve.

Både OBC og Kawamoto metoder bruger acridin orange (AO) som fluorochrom til at plette nukleinsyrerne af malariale parasitter i en prøve. BCP er også en fluorochrom, som pletter nukleinsyrer. AO er uspecifik og pletter nucleinsyrer fra alle celletyper.

Derfor skal eksaminator lære at skelne fluorescerende farvede parasitter fra andre celler og cellulære affald. Følsomhed ved AO-farvning med parasitniveauer på mindre end 100 parasitter / μL har været 41, 7-93 procent.

Specificiteten af ​​AP-farvning for P. vivax og P. falciparum er henholdsvis 52 og 93 procent. BCP-metoden har en følsomhed og specificitet på mere end 90 procent. Vigtige begrænsninger af metoder baseret på AO og BCP er deres manglende evne til at differentiere blandt Plasmodium-arter. AO er farligt og kræver særlige bortskaffelseskrav.

OBC og BCP er mere krævende teknisk end Kawamoto. Kawamoto og AO metoder kræver specielt udstyr og forsyninger og er dyrere. Prisen på et fluorescensmikroskop kunne være en begrænsende faktor for laboratorier, der er interesserede i at udnytte disse metoder.

Påvisning af specifikke nukleinsyresekvenser:

Påvisning af nukleinsyresekvenser specifikke for Plasmodium parasitter kan være nyttige. I PCR-baserede teknikker detekteres amplificeret målsekvens ved interne sonder eller analyseres ved gelelektroforese. En stor fordel ved at anvende en PCR-baseret teknik er evnen til at opdage en 'lav parasitæmi. Infektioner med levende parasitter kan detekteres med 100 procent specificitet.

Sådanne teknikker er dog dyre og arbejdskrævende, kræver omfattende teknisk ekspertise, involverer flere trin og kan ikke bruges til at skelne mellem levedygtige og ikke-levedygtige organismer.

PCR-inhibitorer, som er naturligt forekommende i blodprøver, kan resultere i et betydeligt antal falsk-negative resultater. False-positive resultater er også blevet registreret på grund af overførselskontamination.

PCR-baserede teknikker er blevet brugt til at screene donorer i et område, hvor malaria er endemisk. Sensibiliteten og specificiteten af ​​PCR-baserede metoder, estimeret ved undersøgelse af blodudstrålinger som "guldstandarden", er hver 90 procent eller mere.

Derudover kan yderligere fremskridt inden for PCR-teknologi muligvis skelne mellem levedygtige parasitter fra ikke-gunstige. På nuværende tidspunkt er brugen af ​​sådan teknologi begrænset af behovet for dyre, specialiserede laboratorieudstyr, personale, der er uddannet inden for genetisk teknologi og "clean room" -faciliteter og af en høj pris for enzymer og primere, der anvendes.

Antigen Detektion:

Antistof-detektionstest for malaria var begrænset i følsomhed og deres evne til at skelne aktiv fra tidligere infektioner. Den nye generation, antigen-capture test er i stand til at detektere færre parasitter og at producere hurtige resultater (10-15 minutter). De er kommercielt tilgængelige kits, som omfatter alle nødvendige reagenser, og kræver ikke omfattende træning eller udstyr.

Der er to parasitantigener, der anvendes i de nye, hurtige diagnostiske tests, histidin-rige protein-2 (HRP-2), som kun produceres af P. falciparum og parasit lactat-dehydrogenase (pLDH) antigenet, produceret af alle fire plasmodium arter inficerende mand. Begge antigener udskilles i blodet af alle usædvanlige stadier af parasitten; pLDH antigenet produceres også af gametocytter.

De seneste antigen-capture-test er hurtige og enkle at udføre og har påvisningsgrænser, der kan sammenlignes med mikroskopi af høj kvalitet (dvs. 100-200 parasitter / μL). Når der er mere end 60-100 parasitter / μL, er HRP- 2-baserede tests er stærkt (> 90%) følsomme og (> 90%) specifikke, når de sammenlignes med tykt smearmikroskopi.

I øjeblikket er to sådanne tests kommercielt tilgængelige, ParaSight F testen og den ikt (immunochromatografiske) Malaria Pf Test. Begge test udføres på fingerpickprøver og registrerer kun P. falciparum malaria.

De er baseret på monoklonale antistoffer mod HRP-2, som er immobiliseret på nitrocellulosestrimler for at producere dipsticks eller kartonprøver (ICT Pf Test). I hver test indikeres et positivt resultat ved udseende af en rød linje på teststrimlen, hvor de monoklonale antistoffer immobiliseres.

Begge tests indeholder også en indbygget kontrol; en kontrollinje skal vises for en test, der anses for at være gyldig. Sensibiliteten og specificiteten af ​​ParaSight F-testen er henholdsvis 88 og 97 procent, sammenlignelig med PCR.

Selvom HRP-2-baserede serologiske test har muliggjort hurtig diagnose af falciparummalaria, har de begrænset anvendelse. Da HRP-2 kun er til stede i P. falciparum, er test baseret på påvisning af HRP-2 negativ med infektion forårsaget af vivax, oval eller malaria.

Mange tilfælde af malaria uden falciparum vil derfor blive misdiagnostiseret som malaria-negativ. En anden begrænsning af HRP-2-baserede tests er, at HRP-2 vedvarer i blod længe efter kliniske symptomer er forsvundet, og parasitterne tilsyneladende ryddes fra værten.

Faktisk er HRP-2 blevet opdaget i mumier. Test for dette antigen kan derfor ikke være nyttigt til screening af befolkningen indfødte til endemiske områder, der kan have vedvarende parasitæmi på lavt niveau. Den mulige årsag til persistens af HRP-2 antigen er ikke godt forstået; det kan afspejle tilstedeværelsen af ​​latente, levedygtige parasitter (muligvis et resultat af behandlingssvigt) eller af opløselige antigen-antistofkomplekser.

Persistensen kan også afhænge af typen af ​​anti-malarial terapi indført. HRP-2-signalet kan vare i 19 dage efter tilsyneladende effektiv kinin og doxycyclinbehandling. Også vedvarende HRP-2 antigenæmi er blevet observeret under og efter artemether-terapi.

Andre begrænsninger er specifikt relateret til tekniske aspekter af HRP-2 systemet. For eksempel kan monoklonal IgG anvendt i ParaSight F-systemet krydse reagerer med reumatoid faktor og forårsage falsk positiv respons.

Ikt Pf-testen anvender et monoklonalt IgM, som ikke krydsreagerer, og der er ingen rapporter om falsk-positive reaktioner, der forekommer ved denne test på grund af reumatoid faktor. Ikt Pf testen kræver imidlertid opbevaring ved 4 ° C, hvilket begrænser dets anvendelighed under felt situationer.

pLDH-baserede serologiske analyser:

De nyeste hurtige serologiske test til diagnosticering af malaria er baseret på påvisning af pLDH. Ligesom HRP-2 baserede analyser er disse tests følsomme, specifikke og nemme at udføre, med resultater opnås på mindre end 15 minutter.

De pLDH-baserede analyser kan også differentiere mellem P. falciparum og andre Plasmodium-arter, og da pLDH kun produceres af levedygtige parasitter, er de også nyttige til overvågning af anti-malarial terapi. pLDH fra P. falciparum differentieres fra host LDH (h-LDH) med 3-acetylpyridin-adenin-dinukleotid (APAD), en analog af nicotinamid-adenin-dinukleotid (NAD).

De pLDH-baserede assays er tilgængelige i to former, en halvkvantitativ, tør, dipstick (OptiMAL); og et kvantitativt, immuno-enzymatisk capture-assay. OptiMAL-analysen anvender to monoklonale antistoffer, en specifik for P. falciparum og den anden genkendelse af alle 4 Plasmodia.

Den testede blodprøve (10 μl fingerspids, helblod eller frosset hæmolysat) blandes med 3oμl lyseringsbuffer indeholdende konjugeret monoklonalt antistof. Denne blanding får lov til at opsuge i OptiMAL, pejlestik.

Efter 3 minutter tilsættes 100 μl clearingsbuffer. Hvis P. falciparum er til stede i blodprøven, udvikles tre linjer (herunder en øverst på hver pind, der repræsenterer den positive kontrol) på dipsticks.

To linjer angiver P. vivax, P. malariae eller lejlighedsvis P. ovale. En nyformateret OptiMAL-2-strimmel har tre testlinier og en positiv kontrollinje, som gør det muligt at identificere alle fire Plasmodium-arter.

Hver test anses kun ujævn, hvis kontrollinjen udvikler sig. De monoklonale antistoffer udnyttet i OptiMAL test er blevet udtømmende testet for krydsreaktivitet med LDH fra leishmania, babesia og patogene bakterier eller svampe, og der er ikke fundet tegn på sådan krydsreaktivitet.

HRP-2 viste sig at vedvare godt, efter at perifer parasitæmi havde ryddet. Selv om pLDH-niveauer nøje følger perifer parasitæmi og faldt til uopdagelige værdier 3-5 dage efter kinin og doxycyclinbehandling, faldt niveauerne af HRP-2 antigen kun efter 19 dage, godt efter at patienten er symptom og tilsyneladende parasitfrit.

OptiMAL-analysen bør derfor være et værdifuldt redskab til overvågning af anti-malarial terapi. Afklaring af parasitæmi og clearance af pLDH synes at være parallelle hinanden.

OptiMAL assays, er meget alsidige. OptiMAL testen har henholdsvis 94-88% følsomhed og specificitet på henholdsvis 100 og 99% for henholdsvis P. vivax og P. falciparum sammenlignet med blodudslip.

Denne test kan bruges som et epidemiologisk værktøj, da der i områder, hvor mere end en art af Plasmodium cirkulerer, kan det bruges til at identificere Plasmodium-arterne, der hurtigt inficerer patienter i hver landsby, og tillader folkesundhedspersonale at levere den mest hensigtsmæssige kemoterapi .

konklusioner:

I de sidste par år har bestræbelserne på at erstatte den traditionelle og kedelige læsning af blodudslæt (en metode udviklet for næsten 100 år siden) ført til teknikker til påvisning af malariale parasitter, der giver følsomheder svarende til eller bedre end mikroskopi.

Selvom PCR-baserede metoder er uden tvivl det mest følsomme, er de så dyre og har brug for sådant specialudstyr og træning, at de usandsynligt bliver brugt til rutinemæssig diagnose i de fleste udviklingslande.

De er særligt nyttige til undersøgelser af stamforskelle, mutationer og gener involveret i lægemiddelresistens i parasitten og at vise niveauet af relaterethed mellem stammer forbundet med forskellige malariaudbrud. Den mest lovende, nye malariadiagnostik er de serologiske pejlestikprøver.

Disse test, herunder ParaSight F, ICT Pf Test og OptiMAL, er nemme at bruge, let at tolke og producere resultater i 15 minutter eller mindre. Disse test er næsten lige så følsomme som mikroskopisk undersøgelse af blodudslæt, men kræver ikke højt kvalificeret personale til at udføre eller fortolke resultater.

OptiMAL-testen har de ekstra fordele ved at kunne registrere alle fire Plaspiodium-arter og følge effektiviteten af ​​lægemiddelterapi, da den måler et enzym, der kun produceres af levende parasitter.

Selv om dipstick-testene har to indlysende begrænsninger, bør det heller ikke forhindre, at disse tests modtager udbredt accept. Den første begrænsning er følsomheden. De tre aktuelt markedsførte analyser har følsomhedstærskler på 50-100 parasitter / μ1. Følsomheden for prøver med <50 parasitter / μL er konsekvent 50% -70%.

Dette følsomhedsniveau kan ikke være meget af et problem for dem, der lever permanent i endemiske områder, som ofte ikke behandles, medmindre de har mere end 500 parasitter / μL blod, men kan udgøre et problem i diagnosen malaria hos de personer, der er fra ikke-endemiske områder, men lever, arbejder eller rejser i endemisk område.

Men da langt størstedelen af ​​malariapatienter har niveauer af parasitter langt over 50 parasitter / μL, vil få patienter fejlmeldes, hvis dipstick-testene blev anvendt rutinemæssigt. Den anden begrænsning af sådanne tests, i det mindste i øjeblikket, er deres omkostninger.

Verdenssundhedsorganisationen mener, at diagnosticeringstest for malaria bør koste mindre end US $ 0, 40 pr. Prøve for dem i de endemiske områder. Medmindre dipstick-testene produceres i massive tal, er denne pris uopnåelig og ikke praktisk for producenterne at mødes.

De nuværende omkostninger ved målepindestestene afhænger af køberens beliggenhed og den mængde, der bestilles. Eksempelvis koster omkostningerne ved ICT Pf Tests fra US $ 1, 30 / test i udviklingslande. Para 0Sight F-testene sælger for US $ 1, 20 / test. OptiMAL strippen sælger i øjeblikket for US $ 3, 00 / test.