DNA Replication: Noter om DNA Replication, Reparation og Rekombination

Noter om DNA Replication, Reparation og Recombination!

DNA-replikation:

Halv-konservativ DNA-replikation:

DNA-replikation er en autokatalytisk funktion af DNA. Det sker normalt under S-fase af cellecyklus, når kromosomer er i stærkt udvidet form. Som foreslået af Watson og Crick er DNA-replikation semi-konservativ.

I den semi-konservative replikation vil de to tråde adskille fra hinanden, opretholde deres integritet, og hver vil syntetisere, fra nukleotidens pool, dens komplementære streng. Resultatet ville være, at det nyligt syntetiserede molekyle ville bære eller bevare en af ​​de to tråde fra modermolekylet, og den anden streng ville blive nyligt samlet. Der er tilstrækkelige beviser til at bevise, at dobbeltstrenget DNA virkelig replikerer ved halv-konservativ metode.

Meselson og Stahl's Experiment (1958):

Disse arbejdstagere dyrkede Escherichia coli i et medium indeholdende 15 N isotoper. Efter disse havde replikeret i nogle generationer i dette medium indeholdt begge strengene af dette DNA 15 N som bestanddele af puriner og pyrimidiner. Når disse bakterier med 15 N blev overført til et dyrkningsmedium indeholdende 14 N, blev det konstateret, at DNA adskilt fra frisk generation af bakterier besidder en streng tyngre end den anden.

Den tyngre streng repræsenterer forældrenes streng og lysere, den er den nye, der syntetiseres fra kulturmediet, hvilket således indikerer semi-konservativ metode til DNA-replikation og udelukker både konservative og dispersive modeller af DNA-syntese og replikation.

Konservativ replikation ville ikke producere nogen DNA-molekyler med en "hybrid" -konstitution. Hvis replikation var dispersiv, ville der have været et skift af DNA'et fra "tungt mod" lys gennem hver generation.

Efterfølgende undersøgelser har bekræftet Meselson og Stahls konklusion om, at DNA-replikation er semikonservativ og har udvidet den til mange andre organismer, herunder højere planter og dyr.

Cairns autoradiografi eksperiment:

Han brugte radioaktiv thymin eller tritiateret thymidin. Ved at dyrke E. coli i et kulturmedium indeholdende tritieret thymidin blev radioaktiviteten inkorporeret i datter-DNA-molekylerne.

I autoradiograf viser det duplikerende DNA-molekyle en replikerende gaffel, det punkt, hvor to kæder bliver fire. Efter først replikation anses radioaktiviteten for at være inkorporeret i kun en af ​​DNA-strengene, og begge tråde er fundet at være mærket efter anden replikation. Dette understøtter de semi-konservative tilstande af DNA-replikation.

JH Taylors eksperimenter på Viciafaba root tips (1957) bekræfter også den semi-konservative metode til DNA replikation.

jeg. Diskontinuerlig DNA-replikation:

Okazaki foreslog, at DNA-syntese fortsætter samtidigt på begge DNA-tråde, der udnytter den samme enzym-DNA-polymerase i form af små isolerede fragmenter. Disse segmenter er kendt som Okazaki-stykker og består af 1000-2000 nukleotider. Disse sammenføjes af enzymet polynukleotidligase, som fuldender dannelsen af ​​polynukleotidkæden.

Den diskontinuerlige syntese af DNA understøttes af auto-radiografisk eksperiment.

ii. Unidirectional og tovejsreplikation af DNA:

J. Cairns fra sine eksperimenter konkluderede, at DNA-syntese starter ved et fast punkt på kromosomerne og fortsætter i en retning, men nylige forsøg tyder på tovejsreplikation.

Levinthal og Cairns foreslog, at de to tråde under replikationen ikke adskilte sig fuldstændigt før replikation. I stedet begynder de at pakke ud i den ene ende, og samtidig begynder de udpakket segmenter at tiltrække deres nukleotidpar. På denne måde går udpakning af de oprindelige DNA-tråde og syntese af friske DNA-tråde ved siden af ​​hinanden.

DNA-polymerase:

DNA-polymerase er det primære enzym af DNA-replikation. Dens aktivitet blev først demonstreret af Kornberg i 1956. Den katalyserer den kovalente tilsætning af deoxyribonukleotider til 3'-OH af et tidligere eksisterende nukleotid kaldet som primer.

DNA-polymerase-1-enzym anses nu for at være et DNA-reparationsenzym snarere end et replikationsenzym. Dette enzym er kendt for at have fem aktive steder, nemlig template site, primer site, 5 '-> 3' spaltning eller exonuclease site, nucleosid triphosphat site og 3 '-> 5' spaltningssted (eller 3 '-> 5' exonuclease site ).

DNA-polymerase I:

Det er primært involveret i fjernelse af RNA-primere fra Okazaki eller forstadiefragmenter og påfyldning af de resulterende huller på grund af dens 5 '-> 3' polymeriseringskapacitet. DNA-polymerase I-enzymet kan også fjerne tymindimerer fremstillet på grund af UV-bestråling og fylde spaltet på grund af excision. Dette kaldes proof reading eller redigering funktion af dette enzym.

DNA-polymerase-II:

Dette enzym ligner DNA-polymerase-I i sin aktivitet, men er et DNA-reparationsenzym og frembringer væksten i 5'-> 3'-retning ved anvendelse af frie 3'-OH-grupper.

DNA-polymerase-III:

Det spiller en afgørende rolle i DNA-replikation. Det er et multimert enzym eller holoenzym, der har ti underenheder, såsom a, p, e, θ, г, y, δ, δ ', x og Ψ. Alle disse ti underenheder er behov for DNA-replikation in vitro; Men alle har forskellige funktioner. For eksempel har a-underenhed 3 '-> 5' exonuklease-korrekturlæsning eller redigeringsaktivitet. Kernenzymet omfatter tre underenheder-a, p og θ. Resterende syv underenheder øger processiviteten (processivitet betyder hurtighed og effektivitet, med hvilken en DNA-polymerase udvider voksende kæde).

Eukaryotisk DNA-polymerase:

Eukai yotes (fx gær, rotterlever, humane tumorceller) findes at indeholde følgende fem typer DNA-polymeraser:

(i) DNA-polymerase a:

Dette relativt højmolekylære enzym kaldes også cytoplasmatisk polymerase eller stor polymerase. Det findes både i kerner og cytoplasma.

(ii) DNA-polymerase p:

Dette enzym kaldes også nuklear polymerase eller lille polymerase og findes kun hos hvirveldyr.

(iii) DNA-polymerase y:

Dette enzym kaldes mitochondrial polymerase og er kodet i kernen.

(iv) DNA-polymerase 5:

Dette enzym findes i mammale celler, og PCNA er afhængig af DNA-syntese-processivitet (PCNA = prolifererende celle nuklear antigen).

(v) DNA-polymerase e:

Det var tidligere kendt som DNA polymerase 5II. Dette enzym er PCNA uafhængigt og forekommer i pattedyr HeLa celler og spirende gær.

Den store DNA-polymerase a er det dominerende DNA-polymeraseenzym er eukaryote celler og blev antaget i lang tid at være det eneste enzym involveret i DNA-replikation. Men nu er en yderligere polymerase, nemlig DNA-polymerase 8, også fundet involveret i eukaryotisk DNA-replikation.

DNA Primers:

Disse enzymer katalyserer syntesen af ​​RNA-primere, som er en forudsætning for initiering af DNA-replikation i langt størstedelen af ​​organismer. Før den egentlige DNA-replikation starter, skal korte RNA-oligonukleotidsegmenter, der kaldes RNA-primere eller simpelthen primere, syntetiseres af DNA-primaseenzym under anvendelse af ribonucleosidtriphosphater.

Denne RNA-primer syntetiseres ved kopiering af en bestemt basesekvens fra en DNA-streng og adskiller sig fra et typisk RNA-molekyle, idet primeren efter syntese forbliver hydrogenbundet til DNA-skabelonen.

Primerne er ca. 10 nukleotider lange i eukaryoter, og de fremstilles med mellemrum på den laggende streng, hvor de forlænges af DNA-polymeraseenzymet for at starte hvert okazaki-fragment. Disse RNA-primere udskæres senere og fyldes med DNA ved hjælp af DNA-reparationssystemet i eukaryoter.

I bakterier er to forskellige enzymer kendt for at syntetisere primer-RNA-oligonukleotider - RNA-polymerase (på ledende streng) og DNA-primase (på den laggende streng).

Polynukleotidligase:

Dette enzym er et vigtigt enzym både i DNA-replikation og i DNA-reparation. DNA-ligase katalyserer dannelsen af ​​phosphodiester-bindingen mellem 5'-phosphorylgruppen af ​​et nukleotid og 3-OH-gruppen af ​​den nærmeste nabo ved siden af ​​et nick i en DNA-streng; således forsegler det nicks i en DNA streng.

endonukleaser:

Endonucleaser, især restriktionsendonukleaser, er også vigtige under DNA-replikation såvel som DNA-reparation. Under DNA-replikation kan en endoclease producere et nick i oprindelsen for at initiere replikation, eller det kan inducere nicks at generere en drejning for at lette DNA-afvikling.

Enzymer involveret i åbning af DNA Helix:

DNA helikaser:

DNA-helicaser er ATP-afhængige afviklingsenzymer, som fremmer adskillelse af de to forældrenes tråde og etablerer replikationsgafler, der gradvist vil bevæge sig væk fra oprindelsen. Afvikling af template DNA-helixen ved en replikationsgaffel kan i princippet katalyseres af to DNA-helicaser, der handler i koncert, en kører langs den forreste streng og den anden langs den bageste streng.

Helix-destabiliserende streng (også kaldet enkeltstreng-DNA-bindende proteiner eller SSBP'er):

Bag replikationsgaffelen forhindres de enkelte DNA-strenge fra at tilbagespoles om hinanden (eller danner dobbeltstrengede hårnålsløjfer i hver enkelt streng) ved virkningen af ​​SSB-proteiner. SSB-proteiner binder til eksponerede DNA-tråde uden at dække baserne, som derfor forbliver tilgængelige for templeringsprocessen.

Topoisomeraser (DNA gyraser):

Virkningen af ​​en helicase introducerer en positiv supercoil i dupleks-DNA'et foran replikationsgaffelen. Enzymer, der hedder topoisomeraser, slipper supercoilen ved at fastgøre til den transient supercoil duplex, nicking en af ​​trådene og roterer den gennem den ubrudte streng. Nicken bliver derefter forseglet.

Én type topoisomerase (dvs. topoisomerase I) forårsager en enkeltstrengspause eller en nick, der tillader de to sektioner af DNA-helix på hver side af nick til at rotere frit i forhold til hinanden ved anvendelse af phosphodiesterbindingen i strengen modsat nicket som et drejepunkt. En anden type topoisomerase (dvs. topoisomerase II) danner en kovalent binding til begge tråde af DNA-helix på samme tid, hvilket gør transient dobbeltstrengspause i helixen.

replikon:

Et replikon er enheden af ​​DNA, hvori individuelle replikationsreaktioner finder sted, det vil sige, at den er i stand til DNA-replikation uafhængig af andre segmenter af DNA. Derfor har hver replikon en oprindelse, hvor replikation initieres, og den kan have en terminus, hvor replikationen stopper.

De bakterielle og virale kromosomer indeholder normalt et enkelt replikon / kromosom. Selvom fag T har to oprindelser, en primær og en sekundær, men i nærværelse af primær oprindelse er den sekundære oprindelse som regel ikke-funktionel. I E. coli identificeres oprindelsesstedet som genetisk locus oriC.

En fuldstændig prokaryot oprindelse understøtter følgende tre funktioner: (1) initiering af replikation, (2) kontrol af hyppigheden af ​​initieringshændelser og (3) segregeringen af ​​de replikerede kromosomer ind i dattercellerne.

Origins er blevet identificeret i bakterier, gær, chloroplaster og mitokondrier; deres væsentlige generelle træk er, at de er A: T rige, hvilket kan være vigtigt for at lette afviklingen under replikation. Den bakterielle oprindelse indeholder mange forskellige korte (<10 bp) steder, der er nødvendige for dets funktion; Disse steder adskilles nogle gange af specifikke afstande men ikke af specifikke sekvenser. Disse specifikt lokaliserede steder er nødvendige for bindingen af ​​forskellige proteiner involveret i DNA-replikation.

Flere prokaryote replikoner har specifikke steder kaldet terminus, som stopper replikationsgaffelbevægelsen og derved afslutter DNA-replikation. E. coli-kromosom har to terminii, kaldet Ti og T2, der ligger omkring 100 Kb på hver side af det punkt, hvor replikationsgaflerne ville møde. Hver ende er specifik for en retning af gaffelbevægelsen.

T1 og T2 er anbragt på en sådan måde, at hver gaffel skal passere den anden for at nå den ende, der er specifik for den. Replikeringsafslutningen kræver produktet af tus-gen, som sandsynligvis koder for et protein, som genkender T og T2.

I eukaryoter har hvert kromosom flere replikoner (fx gær, 500; Drosophila, 3.500; mus 25.000; Viciafaba, 35.000). På et givet tidspunkt i S-fase gennemgår kun nogle af disse replikoner replikation; hver replikon synes at være aktiveret på et bestemt tidspunkt i en specifik sekvens. Længden af ​​et eukaryotisk replikon kan variere fra 40 Kb i gær og Drosophila til ca. 300 Kb i Vicia.

Antallet af detekterbare replikoner synes at variere med udviklingsstadiet og cellen eller vævstypen. Dette forklares ud fra vævsspecifik oprindelse, så nogle oprindelser er aktive i nogle væv, mens andre er aktive i nogle andre væv.

Dette eksemplificeres af Drosophila, hvor de tidlige embryonale celler har 10 gange så mange replikoner som dem i de voksne somatiske celler. De foreliggende beviser tyder på, at eukaryotiske replikoner ikke har terminii.

Replicationens troværdighed:

Fejlfrekvensen for DNA-replikation er meget lavere end for transkription på grund af behovet for at bevare betydningen af ​​den genetiske besked fra en generation til den næste. For eksempel er den spontane mutationsrate i E. coli omkring en fejl pr. 10 10 baser inkorporeret under replikation.

Dette skyldes primært tilstedeværelsen af ​​de mindre tautomere former af baserne, som har ændrede baseparingsegenskaber. Fejlfrekvensen minimeres af en række mekanismer. DNA-polymeraser vil kun inkorporere et indkommende nukleotid, hvis det danner det korrekte basepar med template nukleotidet i dets aktive sted.

Den lejlighedsvise fejl detekteres af 3 '-> 5'-korrekturreferenconukleasen associeret med polymerasen. Dette fjerner det ukorrekte nucleotid fra 3'-enden før enhver yderligere inkorporering, så polymerasen derefter indsætter den korrekte base. For at korrekturlæsningsexonukleasen skal fungere korrekt, skal den være i stand til at skelne et korrekt basepar fra en forkert.

Den øgede mobilitet af "unanchored" basepar i selve 5'-enden af ​​nyligt initierede DNA-fragmenters sløvstrengfragmenter betyder, at de aldrig kan vises korrekt og så ikke kan korrekturleses. Derfor er de første få nukleotider ribonukleotider (RNA), således at de efterfølgende kan identificeres som lavtrohedsmateriale og erstattes med DNA-forlænget (og korrekturlæst) fra det tilstødende fragment. Fejl, der undslipper korrekturlæsning, korrigeres af en fejlparametreparationsmekanisme.

Mekanisme for DNA-replikation i prokaryoter:

In vitro DNA-replikation er blevet grundigt undersøgt i E. coli og i phages og plasmider af E. coli. I E. coli involverer DNA replikationsprocessen de følgende tre hovedtrin:

1. Initiering af DNA-replikation:

Denne proces omfatter tre trin: (i) genkendelse af oprindelsen (O), (ii) åbning af DNA-duplex for at danne en region af enkeltstrenget DNA, og (iii) indfangning af DNA-B-protein (dvs. 5'3'-helicase ; virker også som aktivatoren af ​​primase) Således binder DNA-A (eller initiatorprotein) ATP-komplekset ved 9 bp inverterede gentagelsesområder (R,, R,, RvR4) af oriC af E. coli og fremmer åbning af DNA-duplekset i et område på tre direkte gentagelser af 13-bp sekvens (kaldet 13-mers).

Åbningen sker fra højre 13-mer venstre og kræver negativt supercoiled DNA- og HU- eller IHF-initiatorproteiner. Dna B (-helicase) overføres til eksponeret enkeltstrenget DNA og forårsager afvikling af DNA'et i nærværelse af A TP, SSB protein og DNA gyrase (en topoisomerase).

Dette resulterer i afvikling af DNA-duplex, og replikationen fra ori C fortsætter i begge retninger (tovejs); SSB-binding forekommer på enkeltstrengede områder, og to Dna B-komplekser (= primosomer) lægges på hver streng.

2. Forlængelse af DNA-kæden:

Dette trin kræver tilstedeværelsen af ​​følgende enzymer og faktorer: 1. Dna B eller helicase (også kaldet mobilpromotor); 2. primase (Dna G); 3. DNA-polymerase holoenzym (eller DNA pol IIIHH); 4. SSB protein; 5. RNAase H, som fjerner RNA-primere; 6. DNA-polymerase I, som anvendes til at fylde det gap, der er skabt på grund af RNA-primere og 7. DNA-ligase (som omdanner primerløse okazaki-fragmenter til kontinuerlig streng). Under indledning til forlængelsesovergang forekommer følgende hændelser:

(i) Når helikase (eller Dna B) bevæger sig i 5'-> 3'-retningen, genererer den en replikationsgaffel ved at åbne DNA-duplekset.

(ii) DNA-strengen med helicase bliver den lagrende streng. DNA-primase associerer med Dna B-helicase, der danner primosomet, der syntetiserer multiple primere til lagringstreng og enkelt RNA-primer for den ledende streng.

(iii) For syntese af lagstrenget må DNA pol III HE arbejde på den samme streng, som Dna B helicase er bundet til, men den bevæger sig i modsat retning.

(iii) DnaB helicase, Dna Gprimase og DNA pol III FIE arbejder sammen i strengforlængelse. Helikase- og DNA-polymerasamlingen forbliver processiv, dvs. de forbliver tæt bundet til gaffelen og forbliver bundet gennem reaktionen.

Syntese (- forlængelse) af lagrende og ledende tråde foregår ved noget forskellige metoder; det er langt mere komplekst for slankende streng end for den førende streng:

(A) Diskontinuerlig syntese på tilbagestående streng:

1. Primase optages fra opløsningen og aktiveres ved hjælp af helicase (DnaB) til syntetisering af aRNA primer (10 til 20 nt eller nukleotider lang) på den laggende streng.

2. RNA-primere genkendes af DNA pol IIIHH på den laggende streng og anvendes til syntese af forstadier eller okazaki-fragmenter. Faktisk genkendes hver ny RNA-primer af gamma (y) -underenheden af ​​DNA-pol IIIH og indlæst med p-underenheden af ​​den samme polymerase. Denne forudindlæste p-underenhed kan så fange kernen af ​​DNA poly III HE, når den bliver tilgængelig efter afslutning af dets syntetiske job på det foregående okazaki-fragment.

3. Efter færdiggørelse af okazaki-fragmenterne udskæres RNA-primere af DNA-polymerase 1, som derefter fylder de resulterende huller med DNA.

4. Efter DNA-polymerase tilføjer jeg de endelige deoxyribonukleotider i spaltet, der forlades af den udskårne primer, og enzymet DNA ligasen fonnerer phosphodiesterbindingen, som forbinder den frie 3'-ende af primerudskiftningen til 5'-enden af ​​okazaki-fragmentet.

(B) Kontinuerlig syntese på ledende streng:

1. I tovejs DNA-replikation primeres den førende streng en gang på hver af de forældreløse tråde.

2. RNA-primeren af ​​den ledende streng syntetiseres af RNA-polymeraseenzym.

3. DNA pol III HE forårsager forlængelse af den ledende streng og endelig DNA pol 1 og ligase enzymer giver en endelig berøring til ledende streng som i tilfælde af den tilbagestående streng.

DNA-replikation i eukaryoter :

Eukaryot DNA-replikation kræver to forskellige DNA-polymeraseenzymer, nemlig DNA-polymerase a og DNA-polymerase 5. DNA-polymerase 6 syntetiserer DNA'et på ledende streng (kontinuerlig DNA-syntese), mens DNA-polymerase a syntetiserer DNA'et på den laggende streng (diskontinuerlig DNA-syntese). Ud over disse to enzymer, DNA replikation: (1) T antigen; (2) replikationsfaktor A eller RF-A (også kaldet RP-A eller eukaryot SSB); (3) topoisomerase I; (4) topoisomerase II; (5) prolifererende celle nukleare antigen (PCNA, også kaldet cyclin), og (6) replikationsfaktor Cor RF-C.

Processen med eukaryotisk DNA-replikation involverer følgende trin:

1. Inden starten af ​​DNA-syntese er der et presynthetisk stadium på 8-10 minutters varighed for dannelsen af ​​afviklet DNA-kompleks. Dette trin kræver kun tre oprensede proteiner, nemlig T-antigen (T-ag eller tumorantigen), RF-A og topiosomeraser I og II.

2. T-antigenet, der anvender dets DNA-bindende domæne, danner et multi-underenhedskompleks med sted I og sted II i nærvær af A TP og forårsager lokal afvikling.

3. Mere omfattende duplex afvikling sker på grund af association af RF-A og en topoisomerase med - hjælp af DNA-helicase-komponent af T-siden Topoisomeraser hjælper med at afvikle DNA ved at ændre topologi af DNA ved replikationsgaffelen.

4. RF-A- eller SSB-proteiner binder til vikling enkeltstrenget DNA.

5. Primer-RNA-syntesen udføres af primase, som er tæt forbundet med DNA-polymerase ex.

6. DNA-polymerase a hjælper i syntese af et okazaki-fragment i 5'- til 3'-retning.

7. Replikationsfaktor C (eller RF-C) og PCNA (cyclin) hjælper i omskiftning af DNA-polymeraser, således at pol a erstattes af pol 5, som derefter kontinuerligt syntetiseres DNA på ledende streng.

8. Et andet okazaki-fragment syntetiseres derefter fra replikationsgaffelen på den lagrende streng af pol a-primasekompleks, og dette trin gentages igen og igen, indtil hele DNA-molekylet er dækket.

9. RNA-primere fjernes, og hullerne er fyldt som ved prokaryotisk DNA-replikation.

For nylig er rollen af ​​DNA-polymerase e i DNA-replikation blevet understreget, således at tre DNA-polymeraser (a, 5 og e) nu vides at være involveret i eukaryotisk DNA-replikation. A. Sugino og kollegaer har foreslået, at DNA-polymerase a kan fungere ved både de ledende og bagvedliggende tråde (da polymerase a har a-primaseaktivitet), hvorimod polymerase e og polymerase 5 er involveret i forlængelse af henholdsvis de ledende og bindestrenger.

DNA Damage and Repair Mechanism

Typer af DNA-beskadigelse:

1. DNA læsioner:

En ændring i DNA'ens normale kemiske eller fysiske struktur kaldes som DNA-læsioner. Mange eksogene stoffer, såsom kemikalier og stråling, kan forårsage ændringer i nitrogen- og carbonatomernes positioner i basernes heterocykliske ringsystemer og nogle af de exocykliske funktionelle grupper (dvs. keto- og aminogrupperne i baserne).

Dette kan medføre tab af baseparering eller ændret baseparering (f.eks. En ændret A kan baseparre med C i stedet for T). Hvis en sådan læsion må forblive i DNA'et, kan en mutation blive fikseret i DNA'et ved direkte eller indirekte mutagenese.

Alternativt kan den kemiske ændring frembringe en fysisk forvrængning i DNA'et, der blokerer for replikation og / eller transkription, hvilket forårsager celledød. DNA-læsioner kan således være mutagene og / eller dødelige. Nogle læsioner er spontane og forekommer på grund af DNA's iboende kemiske reaktivitet og tilstedeværelsen af ​​normale reaktive kemiske arter i cellen.

For eksempel undergår basiscytosinet spontan hydrolytisk deaminering for at give uracil. Hvis der ikke var noget tilbage, ville den resulterende uracil danne et basepar med adenin under efterfølgende replikation, hvilket giver anledning til en punktmutation. Depurination er en anden spontan hydrolytisk reaktion, der involverer spaltning af N-glycosylbindingen mellem N-9 i purinbaser A og G og C-1 'af deoxyribosesukker og dermed tab af purinbaser fra DNA'et. Sukkerfosfatskelettet i DNA forbliver intakt. Det resulterende apuriniske sted er en ikke-kodende læsion, da information kodet i purinbaser er tabt.

2. Oxiderende skade:

Dette sker under normale forhold på grund af tilstedeværelsen af ​​reaktive oxygenarter (ROS) i alle aerobe celler, for eksempel superoxid, hydrogenperoxid og vigtigst af alt hydroxylradikalet (OH). Denne radikale kan angribe DNA, jeg på flere punkter fremstiller en række oxidationsprodukter med ændrede II egenskaber, for eksempel 8-oxoguanin, 2-oxoadenin og 5-formyluracil. Niveauerne af disse kan forøges med hydroxylradikaler fra radiolysen af ​​vand forårsaget af ioniserende stråling.

3. Alkylering:

Alkyleringsmidler er elektrofile kemikalier, der let tilsætter alkyl (fx methyl) grupper til forskellige positioner på nukleinsyrer, der er forskellige fra dem, der er methyleret ved normale methylerings enzymer. Fælles eksempler er methylmethansulfonat (MMS) og ethylnitrosourea (ENU).

Typiske eksempler på methylerede baser er 7-methylguanin, 3-methyl-adenin, 3-methylguanin og O6-methylguanin. Nogle af disse læsioner er potentielt dødelige, da de kan forstyrre afviklingen af ​​DNA under replikation og transkription. De fleste er også indirekte mutagene; 0-methylguanin er imidlertid en direkte mutagen læsion, da den kan basere med thym under replikation.

4. Bulky addukter:

Cyclobutanpyrimidin-dimerer dannes ved ultraviolet lys fra nabostillede pyrimidiner på en streng ved cyklisering af de dobbeltbundne C5- og C6-carbonatomer i hver base for at give en cyclobutanring. Det resulterende tab af basisparring med den modsatte streng bevirker lokaliseret denaturering af DNA'et, der frembringer en omfangsrig læsion, som vil forstyrre replikation og transkription. En anden type pyrimidindimer, 6, 4-fotoproduktet, resulterer fra dannelsen af ​​en binding mellem C6 af en pyrimidinbase og C4 i den tilstødende base.

Når kulstof tjæren kræftfremkaldende benzo [a] pyren metaboliseres af cytokrom P-450 i leveren, kan en af ​​dets metabolitter (et diol epoxid) kovalent binde til 2-aminogruppen af ​​guaninrester. Mange andre aromatiske aryleringsmidler danner kovalente addukter med DNA. Levercarcinogen aflatoxin B binder også kovalent til DNA.

DNA Reparation:

Reparationssystemerne genkender en række ændringer i DNA for at initiere handling. En celle kan have flere systemer til at håndtere DNA-beskadigelse. Disse systemer omfatter følgende: (1) Direkte reparation, (2) Excision reparation (3) Reparation af fejl, (4) Tolerante systemer og (5) Hentningssystemer.

1. Direkte reparation:

Omvendelsen eller simpel fjernelse af skaden på DNA'et er kendt som direkte reparation, fx fjernelse af de kovalente bindinger mellem de to 4 og to 5 carbonatomer af de to thymrester, der deltager i dannelsen af ​​thymdimere.

Thymdimere dannes almindeligvis på grund af UV-bestråling og interfererer med replikation og transkription. Kelner (1949) observerede, at stort antal bakterier kunne overleve store doser af UV-stråling; hvis de blev udsat for en intens kilde til synligt lys.

Dette fænomen kaldes fotoreaktivering. Det blev senere vist at under UV-bestråling bundet et bestemt enzym selektivt til det bakterielle DNA. Under fotoreaktiveringsprocessen aktiveres enzymet med det synlige lys. Det spalter de thymin-dimerer og derved genopretter dem til deres oprindelige form. Denne reparationsproces er enzymmedieret og lysafhængig.

2. Excision reparation:

I denne reparationsmekanisme udskæres det beskadigede eller ændrede segment af DNA-strengen, og en ny patch af DNA syntetiseres på sin plads. Selvom excisions reparationssystemer varierer i deres specificitet, omfatter hovedbanen følgende tre trin:

(i) Anerkendelse og indsnit:

Den beskadigede / ændrede del af en DNA-streng genkendes af en endonuklease; dette enzym skærer derefter den berørte streng på begge sider af skaden.

(ii) Excision:

En 5'-> 3 'exonuklease (DNA polymerase I) fordøjer det skadede / ændrede afsnit; dette frembringer en enkeltstrenget region i DNA-dobbelthelixen.

(iii) Syntese:

I dette trin tjener den enkeltstrengede region produceret ved excision som en skabelon for en DNA-polymerase, som syntetiserer udskiftningen af ​​det udskårne segment. DNA ligase forsegler så det nick, der forbliver efter syntesen af ​​udskiftningen af ​​den udskårne sektion.

I E. coli skyldes excisionen sandsynligvis 3 '-> 5' exonukleaseaktiviteten af ​​DNA-polymerase I, mens syntesen udføres ved 5'-> 3'-polymeraseaktiviteten af ​​det samme enzym. Excision reparationssystemer er ret almindelige både i prokaryoter og eukaryoter. Nogle af disse systemer genkender generel skade på DNA, mens andre er meget specifikke, fx AP-endonukleaser fjerner riboseresterne fra depureringsstederne. Excision reparation involverer forskellige længder af DNA og er grupperet i følgende tre klasser:

(a) Meget kort patch reparation (VSP):

Dette system omhandler reparation af fejlmatcher mellem specifikke baser.

(b) Kort patch-reparation:

I dette system udskæres ca. 20 baser lang DNA-streng, og skaderne repareres gennem uvr-gener (uvr, A, B, C, E. coli), der koder for komponenter af en reparationsendonuklease. Et andet enzym uvr D er også nødvendigt for helicase aktivitet.

(c) Lang patch reparation:

Dette system indebærer udskæring af ca. 1500 bases lange segmenter, men det kan være, at det udskårne segment måske er> 9000 baser. Det er meget mindre almindeligt og skal induceres af skader, som blokerer for replikation. I E. coli involverer dette system også uvr-gener og DNA-polymerase I.

3. Manglende reparation:

Det indebærer korrektion af uoverensstemmelser eller sammenkobling mellem baser, som ikke er komplementære. Ulemper kan opstå enten (a) under replikation eller (b) på grund af basisændringer (fx deaminering af cytosin til uracil) og resulterer i strukturelle forvrængninger i DNA's dobbelte helix. Disse veksler håndteres i E. coli ved hjælp af det meget korte patch-excisionsreparationssystem, der er beskrevet nedenfor.

Mismatch Repair System i E. coli:

Når der er en fejlparametre i et basepar som i GC -> GT, kan den teoretisk reparere for at give anledning til enten vildtype (GC) eller til en mutanttype (AT). Derfor skal reparationssystemet skelne mellem gamle og nye tråde og reparere kun den nye streng for at genoprette vildtypen.

Dette gøres ved meget kort-patch excision reparationssystem og kræver fire proteiner nemlig Mut L, Mut S, Mut U og Mut H kodet i E. coli henholdsvis af gener mut L, mut S, mut U og mut H. De mismatch fejl produceret under replikation korrigeres af dam reparationssystem.

Gen-dammen fra E. coli producerer en methylase, der methylerer adenin af sekvens GATC på begge DNA-tråde. Replikationen af ​​en fuldt methyleret GATC-sekvens giver en hemimethyleret sekvens, hvori A-resterne i de nyligt syntetiserede tråde er ikke-methylerede.

Den ikke-methylerede tilstand af denne målsekvens anvendes til at identificere den nye streng; baserne omkring stedet for mismatch i den nye streng udskæres og en erstatning syntetiseres. Systemet involverer produkterne af gener mut L, mut S, mut H og uvr D.

Retrieval Systems Reparationer:

Disse systemer kaldes også 'reparation efter replikation' eller 'rekombinationsreparation'. I E.coli er dette reparationssystem baseret på rec A-genet, der producerer Rec A-proteinet. Rec Et protein fungerer i udveksling af tråde mellem DNA-molekyler under genetisk rekombination og fungerer også i single-strand-udvekslingen under rekombinationsreparation. Der synes at være to rec A-veje, en der involverer rec B, C-generne og den anden involverer rec F.

Dette reparationssystem virker, når en strukturforvrængning blokerer for replikation på det beskadigede sted. For eksempel vil E. coli-mutanter, der mangler i excisionsreparation, ikke være i stand til at fjerne thymdimere. I en sådan situation fortsætter replikationen normalt op til de beskadigede steder; DNA-polymerasen stopper replikationen af ​​den berørte streng og genopretter replikation, der hopper forbi det skadede sted.

Den komplementære streng replikeres normalt på det beskadigede sted i den anden streng. Derfor giver replikation en normal afkom af DNA-molekyle og et molekyle, der har tymin-dimeren i en streng og et langt hul i sin komplementære streng. Det afkomne DNA-molekyle med tymin dimer ville gå tabt, medmindre det repareres ved at fylde spaltet i en af ​​dets tråde.

Dette opnås ved hjælp af enkeltstrengsudveksling mellem de to afkom DNA-molekyler; Udvekslingsområdet fylder gapet og induceres af Rec A protein. Som følge af denne udveksling har det normale afkomsmolekyle en enkeltstrenget region, som har et hul. Dette mellemrum repareres ved DNA-syntese.

Tolerance System:

Disse systemer håndterer de skader, der blokerer for normal replikation på det beskadigede sted muligvis ved at tillade replikering af de beskadigede steder med en høj frekvens af fejl. Disse systemer kan være særligt vigtige i eukaryoter, hvor genomstørrelsen er meget stor, og derfor er en fuldstændig reparation af skaden ret usandsynlig.