Agrobacterium-medieret genoverførsel i planter | Bioteknologi (med diagram)

Agrobacterium medieret genoverførsel i planter!

Agrobacterium er en gram-negativ patogen bakterie involveret i at forårsage kronegaldannelses sygdom hos plantearter. Kronegaldannelsen skyldes overførslen af ​​et segment af onkogen (kræftfremkaldende) DNA ind i plantecellen ved sårede steder.

Dette DNA-segment (transfer DNA eller T-DNA) er til stede på stort plasmid kaldet Tumor-inducerende (Ti) plasmider i bakterien. T-DNA'et (ca. 20 kb langt) er integreret i plantekromosomet ved rekombination. En række virulens (vir) gener er involveret i at styre infektionsprocessen. Så når en planterot eller en stamme bliver såret, afgiver det et bestemt svar.

Som svar på disse signaler bliver virgenerne af A. tumefaktioner aktiveret og direkte en række hændelser, der er nødvendige for overførslen af ​​T-DNA'et fra Ti-plasmidet til plantens kromosom. Funktionen af ​​forskellige vir-gener indbefatter en kopi af T-DNA efterfulgt af vedhæftning af et produkt til den kopierede T-DNA-streng for at fungere som leder, efterfølgende tilsættes proteiner sammen med længden af ​​T-DNA'et, muligvis som en beskyttende mekanisme.

Disse åbner til sidst en kanal i bakteriecellemembranen, gennem hvilken T-DNA'et passerer. T-DNA kommer derefter ind i planten gennem såret. Det er imidlertid stadig ikke klart, hvordan det bakterielle DNA bevæger sig fra cytoplasmaen til kernen i plantecellen, eller hvordan T-DNA'et bliver integreret i plantechromosomerne.

For at anvende disse bakterier som en vektor fjernes dens T-DNA-region undtagen grænseregionerne og vir-generne. Transgenet indsættes derefter mellem T-DNA-regionerne, hvor det overføres til plantecelle og bliver integreret i plantens kromosom (figur 1). T-DNA'et klones i Ti-plasmider, der skæres i størrelse og replikeres i E. coli for at lette yderligere manipulation. Disse vektorer mobiliseres i Agrobacterium værtsstammer og bruges til at inficere plantevævene.

Disse inficerede plantevæv dyrkes efterfølgende på medier indeholdende specifikke kemikalier, vækstregulatorer for at lette regenerering af transformerede celler. Udvælgelsen af ​​transformanter udføres i nærvær af et antibiotikum til stede i dyrkningsmediet. De transformerede planter analyseres til sidst for stabil integration og funktionel analyse af det indsatte gen.

Protoplast fusion:

Celler uden cellevæggen betegnes som protoplaster. Disse protoplaster kan optage DNA direkte i nærvær af visse kemikalier (som polyethylenglycol, PEG). Højere koncentration af PEG forårsager permeabilisering af plasmamembran, hvilket tillader optagelse af DNA i protoplaster. Selv elektriske signaler kan bruges til at skabe små huller i plasmamembranen ved at lede en elektrisk strøm.

Dette er kendt som elektroporation. Disse små åbninger hjælper derefter med fremmed DNA-optagelse af protoplaster. Dette følges efterfølgende af cellevægsdannelse og initiering af celledeling. Produktionen af ​​transgene planter ved direkte genoverførsel til protoplaster afhænger imidlertid af et effektivt protoplastsystem til planteregenerering.

Gene-gun eller Biolistic Gene Transfer:

Dette er den nyeste teknik, hvor man kan levere DNA af interesse i en celle ved at ilægge mikropartikler (som guld eller wolfram) ved høj hastighed. Denne proces med at levere DNA kaldes bombardement. Inde i cellen frigives DNA-molekyler fra partiklerne og til sidst bliver dette DNA integreret i værtscelleets nukleare eller organelle genom.

Vævseksplanterne dyrkes efterhånden på medier, der indeholder specifikke hormoner / antibiotika, for at vælge de transformerede planter. Når genet af interesse er overført til den ønskede vært, skal dens stabile integration etableres, hvilket sker ved regenererende planter. Dette opnås ved vævskulturteknikken.

Processen af ​​vævskultur kan stort set opdeles i fire faser:

Trin I:

Inkluderer udvælgelsen af ​​de egnede eksplantater og dens overførsel til næringsmedium.

Trin II:

Inkluderer proliferation af voksende væv på multiplikationsmediet.

Trin III:

Inkluderer overførsel af voksende væv (callus) til medier, hvor det kan differentiere i sine forskellige dele.

Trin IV:

Inkluderer overførsel af plantager til det naturlige miljø. Imidlertid kan gener af interesse tilføjes på to måder som sans og antisense orientering. For at udtrykke eller over udtrykke genet kan man sætte genet i sansorientering. Men hvis man ønsker at blokere det uønskede produkt eller et trin i en biokemisk vej, kan man lægge genet i en antisenseorientering.